Author(s): Cruz, Armando Dulcídio da Silva
Date: 2020
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/63542
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Canabinoides; Receptores canabinoides CB 1; Hipocampo; Plasticidade neuronal; Receptor A1 de adenosina; Neurociências; Teses de doutoramento - 2020; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da Saúde
Caffeine, an adenosine receptors antagonist, and marijuana, a cannabinoid receptor agonist, both affect human cognition. Their effects mostly result from their interference with the endogenous purinergic system and endocannabinoids (eCBs) system in the brain. Neuromodulators such as adenosine and endocannabinoids are important regulators of central nervous system neuronal activity. They are also able to modulate synaptic transmission individually. In the hippocampus, adenosine receptor type 1 (A₁R) and cannabinoid receptor type 1 (CB₁R) are the main receptors for adenosine and endocannabinoids, respectively. Both receptors are G-protein-coupled receptors that activate Gi/o. They are expressed in both inhibitory and excitatory neurons, and also in glial cells such as astrocytes. Chronic caffeine administration exacerbates spatial memory impairment caused by acute tetrahydrocannabinol (THC), which is the main psychoactive molecule of cannabis. In the hippocampus, A₁R and CB₁R are involved in memory impairment caused by CB₁R activation. It has also been shown that CB₁R activation decreases GABA and glutamate release in the hippocampus. These effects are partially reduced by co-activation of A₁R, suggesting an interaction between these modulatory pathways at the level of G-protein activation. The main sources of extracellular adenosine are 1) the extracellular production from the hydrolysis of adenine nucleotides and 2) transport from intracellular adenosine sources. eCB synthesis mostly results from the cleavage of postsynaptic membrane lipids. The activation of postsynaptic G-coupled glutamate metabotropic receptors induces the cleavage of postsynaptic membrane lipids, which is predominantly activated due to high neuronal firing. Thus, eCBs travel in a retrograde manner to activate astrocytic and nerve-terminal CB₁R, which inhibit neurotransmitter release and lead to several forms of short-term synaptic plasticity. CB₁Rs are endogenously activated by eCBs, mainly the fatty acids 2-arachidonoyl-sn-glycerol (2- AG) and anandamide. CB₁R agonists impair cognition and prevent long-term potentiation (LTP), synaptic plasticity induced by brief high-frequency neuronal firing, and synaptic transmission. Still, the influence of endogenously formed cannabinoids on hippocampal LTP remains ambiguous. In this study, it was possible to evaluate the influence of endocannabinoids on synaptic plasticity. I also wanted to determine if adenosine, through A₁R, could affect eCB signalling. The deletion or blockade of A₁R did not significantly change the modulatory effect of eCBs on LTP. I did not find evidence of a cross-talk mechanism at the synaptic plasticity level involving the two neuromodulators (A₁R and CB₁R). LTP induced by a weak θ-burst stimulation (wTBS) protocol was facilitated when blocking the action of eCB on CB₁R. In contrast, LTP induced by a strong θ-burst stimulation (sTBS) protocol was inhibited when the endogenous activation of CB₁R was blocked. This suggests that eCB inhibit weak LTP and facilitate strong LTP. The dual effect is mediated by 2-AG, suggesting that it acts as a high-pass filter that likely reduces the signal-to-noise-ratio of synaptic strengthening. The facilitatory effect of eCBs upon strong LTP depends on the activity of GABAergic interneurons. It was also described a modulatory role for A₁R on the CB₁R activation effect on inhibitory postsynaptic potential currents (IPSCs). When A₁R was blocked, the inhibitory effect of CB₁R activation on pyramidal cells was abolished, suggesting that an interaction between A₁R and CB₁R is at play. Overall, this work provides a better understanding of the neuromodulation of synaptic transmission and plasticity in the hippocampal CA1 region. It was able to show that CB₁R plays an important homeostatic role in synaptic plasticity phenomena through an A₁R independent process. However, A₁R seems to play a modulatory role in the action of eCB on inhibitory synaptic transmission.
Os efeitos independentes da cannabis e da cafeína sobre a memória são conhecidos, mas pouco se sabe acerca da interacção entre estas duas susbtâncias moduladoras da memória. A cafeína, um conhecido estimulante do sistema nervoso central, actua através do bloqueio dos receptores de adenosina, que faz parte do sistema purinérgico. A cannabis activa os receptores do sistema endocanabinóide. A adenosina e os endocanabinóides são dois importantes reguladores de actividade neuronal no sistema nervoso central, sendo denominados por neuromoduladores. Os seus receptores específicos são expressos por todo o cérebro, apresentando uma densidade particularmente elevada no córtex, cerebelo e hipocampo. A adenosina activa quatro tipos de receptores acoplados a proteína G, dois de alta afinidade (A₁R e A₂AR) e dois de baixa afinidade (A₂BR e A₃R). Os receptores A₁R e A₃R são acoplados a Gi enquanto que os receptores A₂AR e A₂BR são acoplados a Gs. Os receptores A₃R podem também estar acoplados a proteínas Gq/₁₁. No hipocampo, o receptor da adenosina com maior expressão é o A₁R, estando presente em todos tipos de neurónios, excitatórios e inibitórios, e também em células da glia tais como os astrócitos. A adenosina extracelular tem origem em dois principais processos: 1) hidrólise de nucleótidos de adenina, como por exemplo do ATP e 2) transporte de adenosina intracelular para o meio extracelular através de transportadores. Os endocanabinódes actuam em dois tipos de receptores acoplados a proteínas Gi/o , CB₁R e CB₂R. Os CB₁R são os receptores mais abundantes no sistema nervoso central, particularmente no cortéx e hipocampo. Os endocanabinóides, substâncias lipídicas, são sintetizados maioritariamente no neurónio pós-sináptico, sendo depois libertados para a fenda sináptica, onde activam receptores presinápticos específicos. Existem dois endocanabinóides principais, 2-araquidonilglicerol (2-AG) e a anandamida, que têm vias de síntese distintas. A síntese do 2-AG é exclusivamente pós-sináptica enquanto que a síntese de anandamida pode ocorrer também ao nível do terminal pré-sináptico. O hipocampo é uma estrutura cerebral associada a aquisição de memória espacial e declarativa. Foi demonstrado que administração crónica de cafeína exacerba o défice de memória pela injecção de tetra-hidrocanabinol (THC), principal substância psicoactiva da cannabis. Este efeito é dependente de CB₁R e poderá ser explicado pela sobreexpresão dos A₁R em consequência de consumo crónico de cafeína. Há também descrições de que o A₁R modula negativamente a capacidade inibitória dos CB₁R na transmissão excitatória e inibitória. Considerando o desconhecimento sobre a interacção entre o sistema endocanabinóide e da adenosina em processos de plasticidade neuronal, o presente estudo teve como objectivo inicial a análise do efeito dos receptores hipocampais A₁R e CB₁R a nível da transmissão sináptica e da plasticidade sináptica. Para responder a estas questões foi planeado e executado um trabalho experimental que envolveu o registo da actividade eléctrica neuronal no hipocampo de ratinhos através de técnicas eletrofisiológicas ex vivo (nomeadamente registos extracelulares e registos de patch-clamp). Foram utilizadas duas populações de ratinhos, alelo selvagem (wild-type, em inglês) e com deleção total dos A₁R. Para o estudo da plasticidade sináptica foi utilizado o modelo de potenciação de longa duração (LTP, em inglês). É um modelo celular de aprendizagem associativa e tem como expressão a manutenção, por um tempo prolongado, da potenciação da transmissão sináptica excitatória devido a uma estimulação de alta frequência nos seus aferentes. Relativamente ao mecanismo de interacção A₁R e CB₁R em termos de plasticidade sináptica, foi demonstrado que os A₁R não interferem, endogenamente, na neuromodulação exercida pelos CB₁R na LTP. Adicionalmente, ao analisar a acção inibitória dos CB₁R na transmissão sináptica inibitória que projecta sobre neurónios piramidais, observou-se que o bloqueio dos A₁R previne essa acção dos CB₁R. Sugere-se assim uma possível interligação A₁R-CB₁R ao nível da comunicação entre interneurónios e células piramidais da região de CA1. Para uma caracterização detalhada da acção dos endocanabinoides sobre a plasticidade sináptica, e dado que a libertação dos dois neuromoduladores, adenosina e endocanabinóides, depende da potência e da duração do estímulo de alta frequência, foram utilizados dois protocolos distintos para indução da LTP. Surprendentemente, observou-se a existência de um efeito bifásico dos endocanabinóides na LTP. Na LTP induzida pelo protocolo mais fraco, os resultados obtidos são compatíveis com a conclusão de que os endocanabinóides inibem a LTP enquanto que no protocolo com indução mais forte, que induz maior libertação de endocanabinóides, verificou-se exactamente o oposto, permitindo concluir que os endocanabinoides facilitam a LTP. Os resultados deste estudo sugerem que os endocanabinóides funcionam como filtro passa-alto de maneira a reduzir o ruído com a inibição de sinais mais fracos e potenciando sinais mais fortes. Os resultados sugerem que o endocanabinóide responsável por este efeito bifásico é o 2-AG através da activação endógena dos receptores CB 1 localizados nos neurónios interneurónios inibitórios, GABAergicos. Os astrócitos não parecem participar nesta modelação. Neste trabalho, foi ainda avaliado o efeito da activação exógena dos CB₁R utilizando o agonista WIN 55,212-2. A perfusão do WIN 55,212-2 levou a uma diminuição significativa da potenciação para valores quase nulos, utilizando o protocolo mais forte de indução de LTP. O mesmo efeito foi observado na população de murganhos com deleção do A₁R. O mesmo resultado foi obtido aquando do aumento de concentração endógena de anandamida produzida, sugerindo assim um efeito inibitório sobre a LTP. Quando testados fármacos que induzem aumento de 2-AG endógeno observou-se um aumento da potenciação de longa duração. O conjunto dos resultados sugerem uma proeminência do sistema inibitório via sistema endocanabinóide na potenciação de longa duração. Aliado a este facto, três quartos dos neurónios que expressam CB₁R são interneurónios sendo por isso revelante investigar no futuro que tipo de interneurónios estão associados a este efeito de filtragem. Para avaliar os efeitos dos receptores hipocampais A₁R e CB₁R a nível da transmissão sináptica e da supressão da inibição induzida pela despolarização., do ingês “depolarisation-induced suppression of inhibition”, (DSI), foi utilizada a técnica de whole cell patch-clamp para registo de correntes sinápticas inibitórias em células piramidais localizadas no Stratum Pyramidale na área de CA1 do hipocampo. Foram utilizados murganhos wild type. Relativamente à modulação da transmissão sináptica, verificou-se que a activação dos CB₁R pelo WIN 55,212-2, inibe a transmissão sináptica em cerca de metade da população dos neurónios avaliados. Este resultado está de acordo com os dados obtidos na literatura, dado que nem todos os neurónios expressam o receptor CB1. Também foi verificado que a perfusão de um antagonista selectivo de A₁R, previne o efeito inibitório de activação exógena dos receptores CB₁R. Em suma, este projecto permitiu aprofundar o conhecimento sobre a neuromodulação da transmissão e plasticidade sináptica ao nível da região da CA1 do hipocampo. Foi identificado pela primeira vez o efeito bifásico da activação dos CB₁R por endocanabinóides, especificamente pelo 2-AG, indicando assim um importante contributo para o controlo homeostático da plasticidade sináptica. Foi também observada uma interligação dos A₁R e CB₁R ao nível da transmissão sináptica inibitória, sendo inexistente ao nível da plasticidade sináptica.
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