Comparison and Optimization of DNA Extraction Methods from Cervical Cells Collected in ThinPrep® PreservCyt

• Author(s): Silva, Andreia ; Salta, S ; Henrique, R ; Jerónimo, C
• Date: 2020
• Origin: Citotech Online - Case Review
• Subject(s): Cancro do colo do útero; HPV; DNA; Extração; Metilação de DNA; Cervical cancer; HPV; DNA; Extraction; DNA methylation
• Document Type: Journal article
• Language: Portuguese

Description

Cervical cancer is the ninth leading cancer in women in Portugal. Cervical cancer screening methods have changed since the implementation of the cytology-based test developed by George Papanicolaou until the human papillomavirus-based screening. Nowadays, new biomarkers like deoxyribonucleic acid (DNA) methylation has been proposed as potential triage method of samples testing positive for human papillomavirus The aim of this study was to optimize and compare three different DNA extraction methods for further methylation analysis. DNA from sixteen cervical samples collected in ThinPrep® PreservCyt was extracted by the phenol-chloroform method, by QIAamp® MinElute™ Media kit (QIAGEN, Hilden) and by Blood DNA Isolation Mini Kit (Norgen Biotek, Ontario). After quantification, DNA was modified by Sodium Bisulfite and amplified by Quantitative Specific Methylation Polymerase Chain Reaction for β-Actin gene. Finally, Cycle threshold (Ct) mean values were evaluated. The phenol-chloroform method had the higher sample input and, consequently allowed for a higher DNA quantity. Fifteen mL of sample allowed for get 13500ng with the phenol-chloroform method meanwhile 2mL of sample provided 8940ng with QIAamp® MinElute™ Media kit and 927ng with Blood DNA Isolation Mini Kit. However, commercial kits presented higher efficiency and advantages as being less time consuming and easier to perform. No significant differences were observed for amplification Ct values between the three DNA extraction methods neither between samples archived for ten or fourteen months. Concluding, the three methods provided DNA to amplification but the optimization of commercial kits turned out to be more advantageous.

O cancro do colo do útero é o nono cancro mais incidente nas mulheres em Portugal. O rastreio desta neoplasia tem evoluído desde a citologia convencional até à deteção do Vírus do Papiloma Humano em colpocitologia cervico-vaginal em meio líquido. Atualmente, novos marcadores biomoleculares, como alterações na metilação do ácido desoxirribonucleico (DNA), têm sido estudados como meio de triagem de mulheres infetadas pelo Vírus do Papiloma Humano. O objetivo deste estudo foi otimizar e comparar três métodos de extração de DNA para análise da metilação. Extraiu-se DNA de dezasseis amostras de colpocitologia, colhidas em ThinPrep® PreservCyt™, através do método fenol-clorofórmio e dos kits QIAamp® MinElute™ Media (QIAGEN, Hilden) e Blood DNA Isolation Mini Kit(Norgen Biotek, Ontario). Após quantificação, o DNA foi modificado por bissulfito de sódio e amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa de Metilação Específica para o gene β-Actina. Os valores médios de Cycle threshold (Ct) foram avaliados.O método fenol-clorofórmio teve maior input, e consequentemente conferiu maior quantidade de DNA. Com 15mL de amostra obteve-se 13500ng pelo método fenol-clorofórmio enquanto com 2mL de amostra se obteve 8940ng do kit QIAamp® MinElute™ Media e 927ng do Blood DNA Isolation Mini Kit. Contudo, os kits apresentaram maior eficácia de extração, bem como maior rapidez e facilidade de execução. Não se verificaram diferenças significativas entre os valores médios de Ct de cada método de extração nem entre amostrasarmazenadas durante dez ou catorze meses. Concluindo, os três métodos permitiram obter DNA para amplificação mas a otimização dos kits de extração revelou-se ser a opção mais vantajosa.