Author(s): Radhouani, Hajer
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/4245
Origin: Repositório da UTAD
Subject(s): Bactéria (Escherichia coli, Enterococcus spp); Resistência microbiana a medicamentos; Genómica; Proteómica; Animal selvagem
As ferramentas genómicas, proteómicas e bioinformáticas permitem um conhecimento mais aprofundado sobre a fisiologia e estrutura bacterianas e também dos mecanismos envolvidos na resistência antimicrobiana. A resistência aos antimicrobianos tem evoluído e disseminado entre bactérias, representando uma séria e crescente ameaça para a saúde pública. No entanto, esta resistência tem sido detectada também na ausência de exposição antimicrobiana em animais selvagens, suscitando questões acerca dos mecanismos de ocorrência e persistência de estirpes resistentes sob condições similares, e as implicações para estratégias de controlo de resistência. Com o objectivo de estudar a resistência antimicrobiana em Escherichia coli e Enterococcus spp., foram recolhidas 151 amostras fecais de três espécies de animais selvagens nomeadamente gaivotas-de-patas-amarelas (Larus cachinnans, 57), águias-de-asa-redonda (Buteo buteo, 42) e raposas-vermelhas (Vulpes vulpes, 52). As amostras de gaivota foram recolhidas na reserva natural das Berlengas, as de águia no parque nacional da Peneda-Gerês e em outras áreas de conservação de Portugal e as amostras de raposa foram recolhidas no Norte de Portugal durante o período sazonal de caça. Através de placas de Levine e Slanetz-Bartley sem antibiótico foram isolados um total de 111 E. coli (73,5%) e 135 enterococos (89,4%). Após o isolamento em placas selectivas suplementadas com cefotaxima (CTX) e vancomicina, respectivamente, a ocorrência de E. coli produtoras de β- lactamases de amplo espectro (BLAE) foi de 12,7% (gaivotas, 19,3%; águias, 15,2%; raposas, 4%) e a prevalência de enterococos resistentes à vancomicina (ERV) foi de 20,4% (gaivotas, 10,5%; águias, 36,4%; raposas, 21,1%). Todos os isolados de E. coli CTX-resistentes revelaram um fenótipo de resistência à cefotaxima e/ou à ceftazidima, apresentando um resultado positivo para a produção de BLAE. O genes da β-lactamase mais predominante foram os genes blaTEM-52 e blaCTXM-32 (34,8%) juntamente com os genes blaCTX-M-1 (17,4%), blaSHV-12 (8,7%), blaOXA-1 e blaCTX-M-14a (4,3%). A maioria dos isolados de E. coli produtores e não produtores de BLAE foram multirresistentes, demonstrando níveis elevados de resistência à tetraciclina (57,5%), estreptomicina (53%) e sulfametoxazol/trimetoprim (35,1%), devido à presença dos genes tet(A) e/ou tet(B) (81,7%), o gene aadA (45,1%) e a diferentes combinações de genes sul (97,8%), respectivamente. O gene de virulência mais comum foi o fimA (63,3%) sendo que a maioria dos isolados de E. coli pertenciam aos grupos filogenéticos A (39,1%) e B1 (27,3%). Entre os isolados de enterococos resistentes e não resistentes à vancomicina, as espécies mais comuns foram E. faecium e E. faecalis. Foram detectados níveis elevados de resistência à tetraciclina e à eritromicina e os perfis genotípicos de resistência foram diversos nestes isolados, o genótipo mais comum foi tet(M)+tet(L)+erm(B). No que respeita a factores de virulência sendo os genes gelE, hyl, cpd, esp e agg foram os mais predominantes. Foram encontrados isolados de ERV com resistência adquirida à vancomicina (genótipo vanA) em 11,3% das amostras fecais analisadas; e 9,1% das amostras apresentaram ERV com resistência intrínseca à vancomicina (genótipo vanC1). Através da análise por MLST (Multilocus Sequence Typing) conclui-se que os isolados vanA-E. faecium pertencam ao ST273 e ST262 (complexo clonal CC17) e também ao ST5. As estirpes de E. coli produtoras de BLAE e de enterococos com vanA foram também estudadas através de uma abordagem proteómica detalhada abrangendo electroforese bi-dimensional (E2D) e identificação por espectrometria de massa com ionização a laser assistida por matriz com analisador tempo de voo (MALDI-TOF MS). Um total de 686 spots foram excisados a partir dos geis E2D de 4 estirpes de E. coli produtores de BLAE e 3 estirpes de ERV dos quais 562 proteínas foram identificadas com sucesso (81,9%) e caracterizadas por interrogação de base dados. As proteínas identificadas foram associadas a diferentes funções biológicas, tais como glicólise, transporte, biossíntese, resistência aos antibióticos, entre outros. Os resultados obtidos em E. coli e enterococos revelaram a presença de proteínas envolvidas na resposta ao stress, tais como as proteínas chaperone DnaK, WrbA, GroL, entre outras. Adicionalmente, a proteína VanA (MM: 37419,10938 / PI: 5,79), que evita a ligação da vancomicina/teicoplanina, foi identificada ao analisar o proteoma total de estirpes de enterococos vanA. A descrição detalhada das proteínas identificadas em estirpes BLAE e ERV pode proporcionar novos alvos para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Esta abordagem revelou perfis proteicos de bactérias resistentes e em resposta a várias condições de stress antimicrobiano que possibilitaram um maior conhecimento dos mecanismos de resistência associados. A análise proteómica quantitativa em classes específicas de proteínas ou subproteomas em estirpes de ERV e de E. coli produtoras de BLAE abrirá novas perspectivas funcionais no estudo de mecanismos de resistência antimicrobiana facilitando a identificação de marcadores de diagnóstico ou prognóstico e a descoberta de alvos terapêuticos. Conclui-se que a prevalência e disseminação de bactérias indicadoras resistentes aos antimicrobianos, como E. coli e Enterococcus spp., em animais selvagens revelaram que estes podem representar um importante reservatório de bactérias resistentes e de genes de resistência. Este estudo revelou também a presença de estirpes portadoras de genes de virulência, pertencendo a complexos clonais de elevado risco, o que acresce às preocupações de saúde pública que surgem da disseminação de ERV e de E. coli produtoras de BLAE em ecossistemas selvagens.
