Author(s): Martins, Filipa
Date: 2024
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/176179
Origin: Repositório Institucional da UNL
Subject(s): Glioblastoma (GBM); Cancer metabolism; Metabolic remodeling; Glutamine reliance; Glutaminase (GLS1); Systemic therapy; Targeted therapy; Blood-brain barrier (BBB); Polyurea dendrimer generation 4; functionalized with lactate (PUREG4-LA12); PUREG4-LA12-siRNA dendriplex; Metabolism-based therapy; Ciências Médicas
The experimental data included in this thesis are sourced from manuscripts that have been previously published or are currently undergoing preparation for publication. I hereby state that I have fully participated in the conception, execution and in the validation of the experimental work, in the analysis and interpretation of the collected data as well as in the preparation of the manuscripts. The experimental work developed in this thesis was approved by the Ethics Research Committee of NMS|FCM-UNL (158/2021/CEFCM) and by the Ethics Committee of IPOLFG (UIC/1137-E).
Glioblastoma (GBM), the most aggressive and lethal Central Nervous System (CNS) malignancy, poses significant therapeutic challenges due to its high genetic and metabolic heterogeneity, invasiveness, and the protective nature of the blood-brain barrier (BBB). GBM patients face a median overall survival (OS) of only 8 months following diagnosis, since disease progression and relapse are very common. There are still some gaps in the GBM biology knowledge, and the better understanding of GBM metabolic remodeling can allow the implementation of new therapeutic strategies. Utilizing transcriptomics data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, we identified metabolism-related patterns that could inform clinical applications, such as the discovery of new biomarkers and putative therapeutic targets for drug development. Our in vitro findings indicate that GBM cell lines U251 and U-87MG adapt to various organic compounds (glucose, lactate, glutamine, and glutamate), demonstrating their metabolic flexibility. These cells fulfill glycolysis in the presence of glucose and are capable of producing and consuming lactate. Importantly, glutamine dependence was highlighted, with glutamine and glutamate availability favoring biosynthesis pathways, as observed by increased expression of genes involved in fatty acid synthesis. These results underscore the informative power of metabolism and the importance of metabolic profiling in personalizing GBM treatment. Glutamine metabolism is essential for GBM cell survival and tumor growth. Indeed, GBM is considered glutamine addicted, since the metabolic remodeling that occurs involves the abrogation of glutamine synthetase (GS) and increased expression of glutamine transporters. Current strategies targeting glutamine metabolism have proven difficult to clinically implement due to adverse effects, the BBB hurdle, and the complexity of brain tumor biology. This study hypothesizes that exploiting GBM glutamine dependence is a viable treatment strategy and proposes two approaches: a systemic glutaminase (GLS1) treatment and a targeted theranostics approach using polyurea dendrimers generation four (PUREG4) functionalized with lactate (to target monocarboxylate transporter 1, MCT1) to deliver small interfering RNAs (siRNAs) anti-GLS1 across the BBB into the tumor. Systemic GLS1 treatment has the advantage that it does not need to cross the BBB, affecting only the GBM cells since the other cells retain the ability to synthetize glutamine. GLS1-therapy can effectively reduce glutamine availability, impairing GBM cell metabolism and survival. This therapy was validated in a GBM orthotopic xenograft murine model, inducing increased OS and delayed cachexia. Metabolomic analysis of serum collected during tumor induction and treatment revealed statistically significant differences in metabolic profiles of GLS1-treated mice, suggesting that these profiles could be used to monitor therapeutic response. Additionally, we explored a theranostics approach using polyurea dendrimers. PUREG4-LA24 dendrimers were able to efficiently deliver cytotoxic drugs (selenium-chrysin – SeChry and temozolomide –TMZ) to GBM cells and induce cell death, with higher impact in U251 cell line, since it has higher MCT1 expression. The viability of b.End3, the cell line used as a BBB model, was also affected by SeChry, suggesting induction of BBB disruption, which can benefit drug delivery. To affect the glutamine metabolism, we tested an anti-GLS1 siRNA. Knockdown of GLS1 with siRNA induced cell death, while affecting the metabolism of GBM cell lines. Therefore, we formed the dendriplexes PUREG4-LA12-siRNA anti-GLS1, which efficiently knockdown GLS1 expression when cells were directly exposed. Moreover, this dendriplex successfully crossed an in vitro BBB model, altering GBM cell lines exometabolome. Further studies are warranted to validate these results in vivo and to explore the combinatory potential of this approach with existing GBM therapies. Our findings highlight the potential of targeting glutamine metabolism in GBM, presenting two different metabolism-based strategies to impair GBM metabolism and survival. This approach offers a novel and promising direction for GBM therapy, emphasizing the importance of personalized metabolic profiling and metabolism-targeted interventions to enhance clinical outcomes.
glioblastoma (GBM) é um glioma de alto grau (grau IV da Organização Mundial de Saúde), sendo o tumor mais agressivo e letal do sistema nervoso central (SNC). Os GBM representam 14,2% de todos os tumores do SNC e 50,9% de todas as neoplasias malignas do SNC. São mais comuns no sexo masculino e a sua incidência é maior nos idosos, tendo uma idade mediana de diagnóstico de 66 anos. São altamente agressivos devido à sua localização, alta taxa de proliferação, elevada heterogeneidade e padrão infiltrativo/invasivo. O tratamento baseia-se numa abordagem multidisciplinar, incluindo remoção cirúrgica do tumor, seguida de radioterapia e quimioterapia adjuvante (com temozolomida, TMZ). No entanto, devido à elevada invasão dos tecidos envolventes, a remoção cirúrgica completa do tumor é dificultada, sendo muito comum a progressão e a recidiva da doença. Assim sendo, os pacientes com GBM enfrentam uma sobrevivência global mediana (OS) de apenas 8 meses após o diagnóstico, pelo que é urgente compreender melhor a biologia do GBM para a implementação de novas estratégias terapêuticas. As células cancerígenas passam por uma reprogramação metabólica para sustentar o crescimento do tumor, sendo esta considerada uma característica distintiva (Hallmark) do cancro. As adaptações metabólicas das células malignas também dependem das células não neoplásicas presentes no microambiente tumoral, que interagem simbioticamente com partilha de moléculas sinalizadoras e orgânicas, contribuindo para a sobrevivência de todo o sistema. A reprogramação metabólica em cancro tem sido alvo de muitos estudos nos últimos anos. Apesar da quantidade significativa do conhecimento produzido pela investigação, a sua implementação no tratamento tem sido limitada. Nesse sentido, decidimos explorar a reprogramação metabólica que ocorre em GBM e adotar estratégias que permitem tirar partido desta em prol do melhoramento terapêutico. A glutamina é um aminoácido não essencial que desempenha um papel fundamental no metabolismo das células em proliferação, incluindo as células neoplásicas. É utilizada como fonte de azoto, essencial para a síntese de nucleótidos e proliferação celular, e como fonte preferencial de carbono, fornecendo carbonos para o ciclo dos ácidos tri-carboxílicos (TCA), substituindo completamente o uso de glucose em determinados tumores. Para além disso, a glutamina é um precursor do glutamato, necessário para a síntese de aminoácidos não essenciais e síntese de glutatião (GSH), que é composto por glutamato, cisteína e glicina e constitui a molécula mais relevante na eliminação de espécies reativas de oxigénio (ROS). Em situação fisiológica, o cérebro é um órgão altamente dependente de glutamina, uma vez que os neurónios não exibem atividade da glutamina sintetase (GS). A glutamina está envolvida no ciclo glutaminérgico (glutamato-glutamina), no qual os astrócitos captam glutamato e sintetizam glutamina, que é posteriormente fornecida aos neurónios, que por sua vez a reconvertem em glutamato através da ação da enzima glutaminase (GLS1). Assim, a glutamina é usada para sintetizar os neurotransmissores glutamato e o ácido γ-aminobutírico (GABA). Portanto, é criada uma interdependência metabólica entre as linhagens de células gliais e neuronais. Em situação fisiopatológica no caso dos gliomas, em específico nos GBM, o metabolismo da glutamina sofre uma reprogramação e as células malignas tornam-se altamente dependentes deste aminoácido. Devido à ausência da GS, estes tumores não são capazes de sintetizar glutamina, pelo que aumentam a sua capacidade de importação e consumo de glutamina pelo aumento da expressão de transportadores, como o ASCT2 e o SNAT3. Por outro lado, os transportadores de glutamato, como o GLT-1, são expressos em níveis baixos, pelo que a glutamina consumida é canalizada para a produção de glutamato e eventualmente GSH. Os níveis elevados de GSH alteram o potencial antioxidante celular, tornando estes tumores mais resistentes à radio- e quimioterapia. Isto reforça o metabolismo da glutamina como um possível alvo terapêutico em GBM. Diferentes estratégias direcionadas ao controlo do consumo de glutamina têm sido abordadas, como o desenvolvimento de inibidores do transporte de glutamina e glutamato e da atividade de algumas enzimas, como a GLS1 e a GS. No entanto, estas estratégias não têm tido resultados muito promissores, uma vez que são difíceis de aplicar clinicamente, seja por falta de eficácia, efeitos adversos dos fármacos, ou devido a mecanismos de resistência associados à elevada heterogeneidade destas neoplasias. Estes fatores são ainda aliados à inacessibilidade anatómica e molecular do cérebro conferida pela barreira hematoencefálica (BHE), o que torna o tratamento dos tumores cerebrais muito desafiante. Assim, a hipótese desta tese é que tirar partido da dependência em glutamina, pela definição de estratégias que afetam a disponibilidade e consumo de glutamina, provocará distúrbios no metabolismo e crescimento do GBM. Inicialmente, pela análise de dados de transcriptómica da base de dados do The Cancer Genome Atlas (TCGA), identificámos perfis de expressão que permitem perfis metabólicos que podem orientar aplicações terapêuticas, tais como a idêntificação de novos biomarcadores e possíveis alvos terapêuticos. De acordo com isso, os nossos resultados in vitro indicam que asEm situação fisiológica, o cérebro é um órgão altamente dependente de glutamina, uma vez que os neurónios não exibem atividade da glutamina sintetase (GS). A glutamina está envolvida no ciclo glutaminérgico (glutamato-glutamina), no qual os astrócitos captam glutamato e sintetizam glutamina, que é posteriormente fornecida aos neurónios, que por sua vez a reconvertem em glutamato através da ação da enzima glutaminase (GLS1). Assim, a glutamina é usada para sintetizar os neurotransmissores glutamato e o ácido γ-aminobutírico (GABA). Portanto, é criada uma interdependência metabólica entre as linhagens de células gliais e neuronais. Em situação fisiopatológica no caso dos gliomas, em específico nos GBM, o metabolismo da glutamina sofre uma reprogramação e as células malignas tornam-se altamente dependentes deste aminoácido. Devido à ausência da GS, estes tumores não são capazes de sintetizar glutamina, pelo que aumentam a sua capacidade de importação e consumo de glutamina pelo aumento da expressão de transportadores, como o ASCT2 e o SNAT3. Por outro lado, os transportadores de glutamato, como o GLT-1, são expressos em níveis baixos, pelo que a glutamina consumida é canalizada para a produção de glutamato e eventualmente GSH. Os níveis elevados de GSH alteram o potencial antioxidante celular, tornando estes tumores mais resistentes à radio- e quimioterapia. Isto reforça o metabolismo da glutamina como um possível alvo terapêutico em GBM. Diferentes estratégias direcionadas ao controlo do consumo de glutamina têm sido abordadas, como o desenvolvimento de inibidores do transporte de glutamina e glutamato e da atividade de algumas enzimas, como a GLS1 e a GS. No entanto, estas estratégias não têm tido resultados muito promissores, uma vez que são difíceis de aplicar clinicamente, seja por falta de eficácia, efeitos adversos dos fármacos, ou devido a mecanismos de resistência associados à elevada heterogeneidade destas neoplasias. Estes fatores são ainda aliados à inacessibilidade anatómica e molecular do cérebro conferida pela barreira hematoencefálica (BHE), o que torna o tratamento dos tumores cerebrais muito desafiante. Assim, a hipótese desta tese é que tirar partido da dependência em glutamina, pela definição de estratégias que afetam a disponibilidade e consumo de glutamina, provocará distúrbios no metabolismo e crescimento do GBM. Inicialmente, pela análise de dados de transcriptómica da base de dados do The Cancer Genome Atlas (TCGA), identificámos perfis de expressão que permitem perfis metabólicos que podem orientar aplicações terapêuticas, tais como a idêntificação de novos biomarcadores e possíveis alvos terapêuticos. De acordo com isso, os nossos resultados in vitro indicam que as linhas celulares de GBM (U251 e U-87MG) se adaptam à disponibilidade de diferentes compostos orgânicos (glucose, lactato, glutamina e glutamato), demonstrando flexibilidade metabólica. Estas células realizam glicólise na presença de glucose e são capazes de produzir e consumir lactato. É importante ressalvar a dependência de glutamina, uma vez que a disponibilidade de glutamina e glutamato favorecem as vias de biossíntese, conforme observado pelo aumento da expressão de genes envolvidos na síntese de ácidos gordos. Estes resultados sublinham a importância do perfil metabólico na personalização do tratamento do GBM, tendo sugerido como alvos os transportadores de lactato e o metabolismo da glutamina e dos ácidos gordos. Considerando o metabolismo da glutamina como uma das principais vias metabólicas em GBM, desenvolvemos duas estratégias de terapêutica direcionada a esta via. A primeira estratégia teve como objetivo diminuir a disponibilidade de glutamina com um tratamento sistémico de GLS1. Assim, não é necessário que fármacos atravessem a BHE, e o impacto será sentido predominantemente pelas células de GBM, uma vez que as outras células do organismo mantêm a capacidade de produzir glutamina. Verificámos que a terapia com GLS1 reduziu a disponibilidade de glutamina, prejudicando o metabolismo e a sobrevivência das células de GBM. Esta terapia foi validada in vivo num modelo de murganho, tendo aumentado a OS e retardado a caquexia. A análise metabólica do soro de sangue periférico recolhido durante o tratamento revelou ainda diferenças significativas nos perfis metabólicos dos murganhos tratados com GLS1, sugerindo que esses perfis poderiam ser utilizados como referência à monitorização da resposta à terapêutica. Na segunda estratégia, explorámos a utilização de dendrímeros de poliureia de quarta geração (PUREG4) funcionalizados com lactato, tendo como alvo o transportador de monocarboxilato 1 (MCT1) que é altamente expresso pelas células de GBM. As nanopartículas PUREG4-LA24 demonstraram ser eficazes na entrega de compostos citotóxicos (seleno-crisina (SeChry) e TMZ) às células de GBM, induzindo morte celular. A linha celular U251 foi a mais sensível a esta abordagem, provavelmente devido a apresentar uma expressão mais elevada de MCT1. Para além disso, a viabilidade da linha celular b.End3 (posteriormente usada como modelo murino de BHE) também foi afetada pela SeChry@PUREG4-LA24, sugerindo a indução de disrupção da BHE, o que está de acordo com novas ideias que defendem a disrupção da BHE como forma de melhorar a entrega de fármacos ao SNC. De modo a afetar o metabolismo da glutamina, formámos um complexo com um RNA de interferência (siRNA) anti-GLS1. O siRNA diminuiu a expressão de GLS1,induziu morte celular e afetou o perfil metabólico das linhas celulares de GBM. O complexo PUREG4-LA12-siRNA anti-GLS1 reduziu eficazmente a expressão de GLS1 quando as células foram diretamente expostas. Por outro lado, este complexo atravessou com sucesso o nosso modelo in vitro de BHE, alterando o perfil metabólico das linhas celulares de GBM (exometaboloma). A versatilidade desses dendrímeros permite que sejam usados para diversas estratégias terapêuticas, permitindo o encapsulamento de diversos fármacos e a funcionalização com diferentes compostos. Todavia, mais estudos são necessários para validar estes resultados in vivo e explorar o potencial combinatório desta abordagem com as terapêuticas já aplicadas a GBM. Os nossos resultados destacam a importância do estudo da reprogramação metabólica de células malignas e provam que tirar partido das vulnerabilidades metabólicas favorece o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para GBM. Esta tese enfatiza a importância do perfil metabólico como ferramenta na medicina personalizada e as especificidades metabólicas como foco de intervenções terapêuticas mais especificas e eficazes no controlo da doença.
