Development of advanced release systems for stem cell based therapies

• Author(s): Monteiro, Nelson
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/28875
• Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Subject(s): 620.1:61; 61:620.1
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Neves, N. M.; Reis, R. L.
• Contributor(s): Universidade do Minho

Description

Tese de doutoramento do Programa Doutoral em Bioengenharia

The increasing incidence of bone, cartilage, tendon and ligament injuries is stimulating the development of less invasive surgical procedures and of treatment modalities that overcome the limitations of conventional therapies, while enhancing the functional recovery. Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM) strategies are promising alternatives to stimulate the formation of functional tissues after trauma or disease. The purpose of Tissue Engineering is to develop strategies promoting the development of new tissue similar to that previously lost. It relies on the use of a biomaterial scaffold, which can be combined with cells and bioactive factors. The scaffolds have a significant role in these strategies because they are designed to help and guide the cells to contribute for the tissue regeneration process. A scaffold should mimic the main properties and structure of the extracellular matrix (ECM) of the tissue of interest. The fibrous nature of the natural ECM has led many researchers to focus on the development of fiber-based scaffolds. Electrospinning is a very promising technology that enables for the production of synthetic or natural polymeric ultrafine fibers. These fibers organized in a mesh-like structure have diameters in the submicron range which results in a high surface area-to-volume ratio and high micro-porosity. The meshes have frequently a random orientation distribution or, in some special cases preferential directions of alignment. The electrospun nanofibers can also be used as a bioactive factors delivery system and this has been the subject of intensive research in recent years. However, the control of the bioactive factors release loaded into the electrospun nanofibers has been a challenge due to fabrication processes and fast release of those factors from the electrospun nanofibers. The main goal of this thesis was to develop a multi-functionalized system combining electrospun nanofibers and nanoparticles, namely liposomes, for the release of bioactive factors. Liposomes are well-established nano delivery devices presenting significant advantages, namely a high load carrying capacity, a relative safety and an easy production, as well as a versatile nature in terms of possible formulations and surface functionalization. The objective of the first study was to evaluate the efficacy of the liposomes as carriers of functional bioactive factors. Our results showed that the optimized dexamethasone-loaded liposomes do not have any cytotoxic effect over primary human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs). More importantly, they were able to promote an earlier induction of hBMSCs differentiation into the osteogenic lineage. In the following studies, bioactive agent loaded-liposomes were combined with electrospun nanofibers meshes in order to develop multi-functionalized systems, able to promote a local and sustained delivery of bioactive agents. To achieve this goal, the electrospun nanofiber meshes were functionalized using different techniques, such as UV-Ozone and wet chemicals, to create functional groups (e.g. amino and thiol groups) that allow further immobilization of bioactive agents-loaded liposomes. We immobilized liposomes loading different bioactive agents (i.e. osteogenic differentiation factor, antibiotic and a plasmid encoding a gene of interest) at the surface of electrospun nanofiber meshes made of two different polymers (i.e. polycaprolactone and chitosan) for different applications. The results showed that the dexamethasone released from the liposomes immobilized at the surface of electrospun polycaprolactone NFM can promote the osteogenic differentiation of hBMSCs. The in vitro susceptibility tests confirmed that the antibiotic gentamicin released from the liposomes immobilized at the surface of electrospun chitosan nanofiber meshes do successfully inhibit the growth of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Therefore, the developed system could be successfully used as wound dressing, preventing possible infections caused by common pathogens. We also demonstrated that liposomes encapsulating a plasmid encoding the transcription factor gene RUNX2 and immobilized at the surface of electrospun polycaprolactone nanofiber meshes can lead to long-term gene expression in vitro, which may be employed to enhance the osteoinductive properties of scaffolds used for bone tissue engineering strategies. The last work of the thesis focused on the simultaneous encapsulation of two bioactive factors (i.e. dexamethasone and ascorbic acid) into the different compartments of a liposome. The dual bioactive agent release study showed that dexamethasone was released more rapidly from the liposomes than ascorbic acid. Dexamethasone and ascorbic acid loaded liposomes promoted the hBMSCs differentiation into the osteogenic lineage both in basal medium and incomplete osteogenic medium (without dexamethasone and ascorbic acid). We propose herein a versatile platform using liposomes and electrospun nanofibers for Tissue Engineering and Regenerative Medicine related applications, namely bone tissue regeneration. This strategy can be used in vitro to induce the osteogenic differentiation of stem cells or, in another perspective, can be applied into a patient wound or tissue defect in order to act as an instructive scaffold either for antibacterial protection or to stimulate the regenerative process

O aumento da incidência de lesões de tecidos como o osso, a cartilagem, os tendões e os ligamentos têm estimulado o desenvolvimento de procedimentos cirúrgicos menos invasivos e de modalidades de tratamento que superem as limitações das terapias convencionais. As estratégias desenvolvidas pela Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa são alternativas promissoras que estimulam a geração de tecidos funcionais após trauma ou doença. O objectivo da Engenharia de Tecidos é desenvolver estratégias que promovam o desenvolvimento dum novo tecido semelhante ao tecido perdido. Para tal, uma estrutura polimérica tridimensional de suporte à cultura celular ou scaffold é desenvolvido, o qual pode ser combinado com células e/ou factores bioactivos. Os “scaffolds” têm um papel determinante nestas estratégias, pois são desenvolvidos com o objectivo de ajudar e orientar as células durante o processo regenerativo. A natureza fibrosa da matriz extracelular (MEC) tem conduzido muitos investigadores a focarem-se no desenvolvimento de “scaffolds” à base de fibras. A técnica de processamento denominada de Electrospinning permite a produção de fibras ultrafinas a partir de biomateriais sintéticos ou naturais. Estas fibras, organizadas numa estrutura tipo rede/malha, têm diâmetros na gama submicrométrica, resultando numa elevada área de superfície e micro porosidade. As nanofibras produzidas por electrospinning, podendo ser usadas como sistemas de libertação de factores bioactivos, têm sido objecto de intensiva investigação nestes últimos anos. No entanto, o desafio está em controlar a liberação de factores bioactivos carregados nessas nanofibras, pois a sua libertação ocorre rapidamente. O objectivo principal desta tese foi desenvolver um sistema multifuncional, baseado na combinação de nanofibras com nanopartículas, nomeadamente lipossomas, para a liberação de factores bioactivos. Os lipossomas são dispositivos de libertação que apresentam vantagens significativas, nomeadamente uma alta capacidade de carga, fácil produção, bem como uma versatilidade em termos de formulações e funcionalização de superfície. Posto isto, o objectivo do primeiro estudo foi avaliar a eficácia dos lipossomas como transportadores de factores bioactivos. Os resultados mostraram que os lipossomas carregados com dexametasona não têm qualquer efeito tóxico sobre as células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hBMSCs). Significativamente, estes lipossomas carregados com dexametasona foram capazes de induzir precocemente a diferenciação das hBMSCs na linhagem osteogénica. Nos seguintes estudos, lipossomas carregados com agentes bioactivos foram combinados com malhas de nanofibras, a fim de desenvolver sistemas multifuncionais, capazes de promover uma distribuição local e sustentada desses mesmos agentes bioactivos encapsulados. Para atingir este objectivo, as malhas de nanofibras foram funcionalizadas mediante utilização de diferentes técnicas, como radiação UV-Ozono e aminólise, para criar grupos funcionais (nomeadamente, grupos aminas e tióis) que permitam a imobilização de lipossomas carregados com agentes bioactivos. Lipossomas carregados com diferentes agentes bioactivos (especificamente, um factor de diferenciação osteogénica, um antibiótico e um plasmídeo que codifica um gene de interesse) foram imobilizados à superfície das malhas de nanofibras fabricadas em dois polímeros diferentes (ou seja, policaprolactona e quitosano) para diferentes aplicações. Os resultados mostraram que a dexametasona libertada dos lipossomas imobilizados à superfície das malhas de nanofibras de policaprolactona promove a diferenciação osteogénica de hBMSCs. Os testes in vitro confirmaram que o antibiótico gentamicina libertado dos lipossomas imobilizados na superfície das malhas de nanofibras de quitosano inibem o crescimento de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Portanto, este último sistema poderá ser utilizado como um penso curativo para feridas, evitando possíveis infecções provocadas por estes agentes patogénicos. Também demonstramos que, lipossomas carregados com um plasmídeo que codifica o factor de transcrição RUNX2 e imobilizados à superfície das malhas de nanofibras de policaprolactona conduzem a uma sobre-expressão de genes osteogénicos a longo prazo, in vitro. Por conseguinte, este último sistema multifuncional pode ser usado para melhorar as propriedades osteo-indutivas de “scaffolds” utilizados nas estratégias de engenharia do tecido ósseo. O último trabalho desta tese focou-se no encapsulamento simultâneo de dois factores bioactivos (isto é, dexametasona e ácido ascórbico) nos diferentes compartimentos de um lipossoma. O estudo de libertação dos dois agentes bioactivos demostrou que a dexametasona foi libertada mais rapidamente do que o ácido ascórbico a partir dos lipossomas. A dexametasona e o ácido ascórbico encapsulados nos lipossomas promoveram a diferenciação das hBMSCs na linhagem osteogénica, tanto em meio basal como em meio osteogénico. Este trabalho de Doutoramento propõe uma plataforma versátil, usando lipossomas e nanofibras, para aplicações relacionadas com Engenharia de Tecidos e a Medicina Regenerativa, nomeadamente, a regeneração do tecido ósseo. Esta estratégia pode ser utilizada in vitro para indução da diferenciação osteogénica de células estaminais, ou, numa outra perspectiva, pode ser aplicado numa ferida dérmica dum paciente ou num tecido traumatizado ou defeituoso, por forma a actuar como um “scaffold” instrutivo para protecção antibacteriana ou estimular o processo regenerativo, respectivamente.