Author(s):
Horta, Pedro Filipe Castela
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/8685
Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
Project/scholarship:
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH%2FBD%2F81821%2F2011/PT;
Subject(s): Malária; Quimioterapia antimalárica; Descoberta de fármacos; Quinolonas; Inibidores do complexo bc1 de P. falciparum; Tautomeria 4-oxo-quinolina/4-hidroxi-quinolina; Malaria; Antimalarial chemotherapy; Drug discovery; Quinolone 3-esters; Inhibitors of P. falciparum bc1 complex; 4-oxo-quinoline/4-hydroxy-quinoline tautomerism; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
Description
Tese de Doutoramento, Química, Especialização em Química Orgânica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016
Apesar dos intensos esforços para controlo da malária, esta doença parasítica milenar permanece como uma das doenças infeciosas conducentes a maiores taxas de mortalidade no mundo. É transmitida pela picada de um mosquito infectado do género Anopheles (apenas a fémea transmite a doença) e causada por um parasita do género Plasmodium. P. falciparum é a mais prevalente de entre as cinco estirpes de Plasmodium que afectam o homem e é também a mais mortal, sendo responsável por cerca de 90% do número total de óbitos por malária registados anualmente. Actualmente, a Organização Mundial de Saúde estima que cerca de 40% da população mundial está em risco de contrair a infecção e que, anualmente, cerca de 600 000 pessoas morrem devido a esta doença. O rápido desenvolvimento de resistência por parte de P. falciparum a pelo menos um dos fármacos antimaláricos convencionais de primeira linha e a terapias baseadas em artemisinina e seus derivados, estimula enormemente a comunidade científica e médica, convocando-a para a investigação e desenvolvimento de novos fármacos antimaláricos eficazes, seguros, acessíveis e fáceis de administrar, preferencialmente direcionados para novos alvos terapêuticos. A combinação farmacológica designada por Malarone® foi lançada pela GlaxoSmithKline para o tratamento e prevenção de malária causada por estirpes multiresistentes. Este medicamento resulta da combinação de dois fármacos antimaláricos: atovaquona e proguanil. A atovaquona é um competidor da ubiquinona, inibindo especificamente o complexo bc1 de P. falciparum através da sua ligação ao sítio Qo deste complexo. O complexo bc1 é essencialmente responsável pela transferência de electrões e translocação de protões ao longo da membrana mitocondrial, formando um potencial de membrana. A sua inibição leva à perda da função mitocondrial (relevante para o fornecimento de intermediários para a síntese de ATP e pirimidina), colapso do potencial electroquímico transmembranar e, finalmente, morte do parasita, validando este complexo como um potencial novo alvo terapêutico para o desenvolvimento de novos fármacos. Além de ser o local de ação da atovaquona, o sítio Qo é também conhecido como o local de ação da estigmatelina (composto natural) e da endoquina (um dos primeiros antimaláricos sintéticos). A endoquina serviu como modelo para o desenvolvimento de análogos (ELQ) que mantiveram o núcleo quinolínico na sua estrutura. Além da sua potencial utilização na quimioterapia da malária, a versatilidade do quimiotipo quinolona tem atraído intensa investigação, originando principalmente 4-oxo-quinolinas com propriedades farmacológicas melhoradas e com potencial aplicação terapêutica noutras áreas, como no tratamento de cancro, hepatite B, hepatite C, SIDA, herpes, infeções fúngicas ou tuberculose. A utilização das quinolonas como agentes antibacterianos teve início em 1963 com a descoberta do ácido nalidíxico. Muitos outros derivados quinolínicos com propriedades farmacológicas foram entretanto sintetizados, destacando-se as fluoroquinolonas norfloxacina, ciprofloxacina e levofloxacina. Nos últimos anos têm surgidos publicações que reportam uma grande variedade de compostos 4-oxo-quinolínicos com grupos éster em posição 3 que demonstram atividade antimalárica em concentrações que se situam na gama nanomolar baixa, atuando por inibição do complexo bc1 plasmodial. No entanto, devido à existência de algumas fragilidades nestes compostos, de que se destacam a fraca solubilidade em meio aquoso e baixa biodisponibilidade oral, esta classe de compostos requer optimização. O projecto de investigação descrito nesta tese foca-se no desenho, síntese e estudo estrutural de uma biblioteca de novas 3-etiléster-4-oxo-quinolinas (quinolonas), introduzindo diversidade química, essencialmente, nas posições 6 e/ou 7 da quinolona. Estudos de docking realizados in silico no sítio Qo do complexo bc1 (de levedura - yeast) sugerem um papel importante dos resíduos His182 e Glu272 no reconhecimento de potentes inibidores. Os mesmos estudos também indicam a importância da presença do grupo carbonilo e do grupo N-H do núcleo quinolónico na formação de ligações por pontes de hidrogénio com os resíduos proteícos His182 e Glu272, respectivamente. Deste modo, a possibilidade de tautomerismo entre as formas 4-oxo-quinolina e 4-hidroxi-quinolina não deve ser negligenciada, no contexto do desenvolvimento desta classe para terapia antimalárica. Esta tese está organizada em 5 capítulos. No capítulo 1 faz-se uma apresentação sobre a malária, bem como sobre os fármacos antimaláricos existentes, seu modo de ação e alvos terapêuticos moleculares. Os fármacos que atuam por inibição do complexo bc1 plasmodial e o uso e síntese de quinolonas em química medicinal também são abordados nesta secção. No capítulo 2 são descritas as abordagens sintéticas e a otimização das condições reacionais seguidas no desenvolvimento de quinolonas selecionadas. De uma forma geral, ao longo deste projecto de doutoramento, as quinolonas foram sintetizadas utilizando a metodologia de Gould-Jacobs. De acordo com esta metodologia ocorre ciclização térmica de um composto α,β-insaturado, derivado de uma anilina. Alternativamente, em algumas situações recorreu-se a uma outra estratégia utilizando o oxicloreto de fósforo. No decorrer destas sínteses, mais especificamente na etapa de ciclização, por vezes obtiveram-se alguns produtos inesperados relacionados com o padrão de substituição aromática decorrente da ciclização térmica e com a possibilidade de tautomerismo ceto-enólico. A possibilidade de tautomerismo entre as formas 4-oxo-quinolina e 4-hidroxi-quinolina suscitou questões do ponto de vista mecanístico e estrutural que são aqui especialmente relevantes, tendo em conta a sua eventual repercussão no perfil farmacodinâmico dos compostos. Assim, foi conduzida uma investigação estrutural detalhada em alguns compostos, de forma a melhor compreender a atividade e reactividade química de derivados de quinolonas, descrita no capítulo 3. Os resultados obtidos com base em estudos de cristalografia de raio X, espectroscopia FTIR acoplada com isolamento em matriz criogénica e cálculos teóricos são apresentados e discutidos, e indicam que, em derivados quinolínicos com um grupo éster em posição 3, a forma enólica (4-hidroxi-quinolina) é mais favorável do que a forma ceto (4-oxo-quinolina). O tautomerismo poderá traduzir-se em alterações nas propriedades químicas e físicas dos compostos, com possíveis implicações nos perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos mesmos. Os compostos sintetizados neste projecto foram testados in vitro contra estirpes sensíveis e resistentes de P. falciparum. Os resultados destes estudos, juntamente com estudos de avaliação da lipofilicidade/solubilidade de alguns compostos, são descritos e discutidos no capítulo 4. Tendo em conta os resultados de atividade biológica obtidos para alguns compostos e o facto de alguns estudos demonstrarem que certas quinolonas conseguem ultrapassar, embora parcialmente, os fenómenos de resistência à atovaquona, neste projecto de investigação estudou-se a possibilidade de ligação de potenciais fármacos a sítios alternativos e diferentes do sítio Qo do complexo bc1. Assim, foram efectuados estudos de simulação por docking no sítio Qi do complexo bc1, estando os resultados também descritos e discutidos no capítulo 4. Adicionalmente, foram sintetizadas algumas quinolonas substituídas com grupos arilo nas posições 2 e 3 que foram testadas contra estirpes de Mycobacterium tuberculosis, o agente responsável pelo desenvolvimento da tuberculose, cuja infeção é muitas vezes concomitante com a infeção pelo parasita da malária. A descrição e discussão deste trabalho é apresentada no capítulo 5. Para finalizar, e numa secção à parte, serão apresentadas as conclusões e considerações finais sobre o trabalho desenvolvido bem como algumas perspectivas para trabalho futuro.
Malaria remains one of the most deadly infectious diseases. The growing spread of resistance by P. falciparum, the most prevalent strain affecting mankind, against conventional antimalarial drugs, urges the search for novel chemotherapeutics directed to new targets. The approval of Malarone® (combination of atovaquone and proguanil) for treatment and prevention of multidrug resistant malaria validated the P. falciparum bc1 complex as target for new antimalarials. Inhibition of bc1 leads to loss of mitochondrial function (relevant to provide intermediates for pyrimidine and ATP synthesis), collapse of the transmembrane electrochemical potential and, ultimately, parasite death. The versatility of the quinolone chemotype has attracted intense research, yielding mainly 4-oxo-quinolines with improved pharmacological properties, targeting a variety of applications, e.g., cancer, hepatitis, HIV, tuberculosis or malaria. Recent publications report on the high activity of some quinolone 3-esters against the plasmodial bc1 protein complex. However, due to some liabilities (e.g. poor solubility and low oral bioavailability), this class requires optimization. The research described within this thesis focus on the design, synthesis, structure and properties of a library of new 4-oxo-quinoline 3-esters substituted at positions 6 and/or 7 of the quinolone pharmacophore. Chapter one presents an introduction to malaria and antimalarial drugs. Other topics in this chapter are the plasmodial bc1 protein complex, the use of quinolones as inhibitors of this drug target and the synthetic routes to quinolones. In chapter two, synthetic approaches and conditions followed in the preparation of our library of quinolones, are described. For a better understanding of chemical reactivity and activity, a detailed structural investigation was undertaken on selected compounds, described in chapter three. Compounds synthesized in this project have been tested in vitro against P. falciparum. The results are discussed in chapter four, jointly with studies of lipophilicity/solubility evaluation and docking simulations. Additionally, selected quinolones were prepared and tested against Mycobacterium tuberculosis (chapter five). Conclusions and prospects for future work are presented in a final section.
