Author(s): Silva, Gonçalo Fradique Lopes da
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3232
Origin: uBibliorum
Project/scholarship: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/PTDC%2FEBB-BIO%2F113576%2F2009/PT;
Subject(s): Cromatografia de troca iónica; Microcalorimetria de fluxo; Carboximetil celulose; Albumina de boro bovino
Ion-exchange chromatography (IEC) is a powerful and widely used separation technique in the biotechnological industry. The greatest challenge of any chromatographic technique is predicting the adsorptive behaviour of biomolecules onto the chromatography resin. This investigation attempts to examine the complexity of protein adsorption onto ion-exchangers and the role of nonspecific effects in the establishment of the adsorptive process. Flow microcalorimetry (FMC) and adsorption isotherms measurements were used to illustrate lysozyme adsorption mechanism on carboxymethyl cellulose (CMC) at both absence and presence of salt (NaCl 50mM) at pH 5. FMC results show that under all the studied conditions the adsorptive process is, as expected in ion exchange, enthalpy driven. Direct correlation between microcalorimetry data and isotherm measurements is observed. Under linear protein concentrations, protein adsorption occurs in the same extension regardless salt concentration. However, when isotherm levelling point is reached, lysozyme reorientation in the presence of salt seems to be the leading mechanism to further adsorption. Under overloaded conditions in the presence of salt, with increasing surface concentration, as a new layer of protein molecules is formed, an expected decrease in the net heat of adsorption is observed, consistent with an energetic equilibrium towards the formation of the new layer. FMC experiments and isotherm measurements were also performed for Bovine Serum Albumin (BSA) adsorption onto Toyopearl® GigaCap Q-650M. The results showed a high overall exothermic process. Secondary adsorption of BSA to the surface, resulting from its alteration of conformation seems to be present. Also, at high protein surface concentrations, high repulsive interactions may occur. All these results confirm that FMC is a powerful technique to illustrate protein adsorption mechanisms in ion-exchange.
A Cromatografia de Troca Iónica (IEC) é uma técnica muito eficaz e bastante usada na indústria biotecnológica. O maior desafio que qualquer técnica cromatográfica é prever o mecanismo the adsorção de biomoléculas nas resinas. Com esta investigação tentou-se examinar a complexidade da adsorção de proteínas em suportes de troca iónica. Os resultados de microcalorimetria de fluxo (FMC) e as isotérmicas permetiram ilustrar os processos de adsorção de lisozima em carboximetil celulose (CMC) tanto na ausência como na presença de sal (NaCl 50mM) a pH 5. Os resultados de FMC mostraram que sob todas as condições utilizadas a adsorção é, tal como esperado em troca iónica, conduzido entalpicamente. Uma correlação direta entre estes resultados e as isotérmicas pode ser estabelecida. Em condições lineares de proteína, a adsorção de lisozima ocorre na mesma extensão independentemente da concentração de sal. Contudo, quando se atinge o ponto de inclinação da isotérmica, a reorientação de lisozima na presença de sal parece ser o mecanismo condutor para uma posterior adsorção. Em condições de sobressaturação, na presença de sal, com o aumento da concentração de superfície e como uma nova camada de moléculas de proteínas é formada, é esperado um decréscimo do calor total da interacção, consistente com um equilíbrio energético a favor da formação dessa nova camada. Foram também realizados estudos em FMC e isotérmicas de adsorção de Albumina de Soro Bovino (BSA) em Toyopearl® GigaCap Q650M. Estes resultados mostraram que o calor global desta interação é altamente exotérmico. É aparente que a alteração de conformação de BSA leva a uma adsorção secundária à superfície. Ainda, a altas concentrações de proteína à superfícies, podem ocorrer elevadas interações repulsivas. Estes resultados confirmam que a FMC é uma técnica eficiente que permite ilustra os mecanismos de adsorção de proteínas em IEC.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)
NSF (American National Science Foundation) NSF – 1246932 (award issued by CBET division of NSF)
