Author(s): Silva, Gonçalo Fradique Lopes da
Date: 2019
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/7155
Origin: uBibliorum
Subject(s): Biomoléculas - Anticorpos monoclonais; Anticorpos monoclonais - Aplicação terapêutica; Purificação de anticorpos - Cromatografia de afinidade; Biomoléculas - Microcalorimetria; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Bioquímica
The monoclonal antibody market has been growing rapidly in the past decades, and the number of therapeutic areas where monoclonal antibodies (mAbs) are employed has been increasing, with cancer and autoimmune diseases being the most represented. There are already more than 50 approved products, representing a staggering $100 billion in global sales. Because of this high demand, antibody manufacturing has been in constant evolution and asking for new, more efficient, and more optimized methods to be applied both in the upstream and downstream processing. Protein A chromatography is step of choice of most of the pharmaceutical companies for the antibody capture in the downstream processing. It is a core unit operation that has been in constant evolution, with the new resins coming to the market having higher binding capacities than their predecessors and improved alkaline stability. Despite of this extensive improvement in Protein A resins, there are still some aspects that lack understanding and deep investigation, specifically the mechanism of interaction between the antibodies and the Protein A ligands, both under linear and overloaded conditions. This knowledge can be used for further enhancement of performance in the mAbs capture step. The knowledge accumulated during the last decades by studying chromatography for proteins bioprocess development has shed some light to the mechanistic understanding of protein–ligand interactions, though based on indirect measurements. Chromatography processes in general are characterized with online and offline sensors that probe the concentration (UV detector), purity (SEC-HPLC), potency (SPR), and structure (MALS, CD) of the product, as well as conductivity and pH that can be measured directly in the chromatography stations (ÄKTA). However, none of these probes operate in situ, i.e. in the chromatographic column where the interaction occurs. The online sensors tackle the elution peak, and the offline sensors analyse the sample afterwards. Therefore, this research consists in a biophysical study on the antibody adsorption to commercial Protein A resins with in-situ sensors, which resulted in an improved understanding of antibody–Protein A interactions, both under linear and overloaded conditions. Flow microcalorimetry was extensively used to retrieve the thermodynamic parameters during antibody adsorption. The microcalorimeter consists on a ID 6 mm × 6 mm column with two thermistors coupled on the column walls that are able to detect small changes in potential during a chromatographic process. The application of the technique to two commercial Protein A resins (MabSelect SuRe with a tetrameric Protein A ligand and TOYOPEARL AF-rProtein A HC with a hexameric Protein A ligand) showed an adsorption profile of exothermic nature with two sub-processes involved. The first and stronger moment was associated to the adsorption process itself. The second moment, less energetic, was associated either to reorganization of the antibody layer and the Protein A chain upon binding, or to antibody binding to a ligand where an antibody molecule would already be bound. These interpretations were reinforced by the small angle X-ray scattering (SAXS) studies. To characterize the changes in the antibody-Protein-A ligand complex and evaluate the influence of the surface topology on adsorption, SAXS was employed using a miniaturized, X-ray-transparent chromatography column packed with the resin. In this way, the protein absorption process could be followed and the formation of a protein layer on the chromatography resin fibres can be observed at the nanoscale and in a time-resolved manner. For the first time it was possible to directly correlate the nanostructure changes inside the column, upon adsorption and during elution. It was demonstrated the possibility of heterogeneous binding throughout the bead network depending on the resin saturation. By application of the broken rod model and under resin saturation it was proposed that an average of 1.2 antibodies adsorb per Protein A ligand in MabSelect SuRe at the outermost domains. Further investigation was performed at different surface concentrations in order to evaluate differences in the organization and stoichiometry in the different zones of the isotherm. The experimental data, analysed by the pearl necklace model, was compared with crystallographic structures of an IgG1 and a tetrameric chain of the B domain of Staphylococcal Protein A (the native form of the Protein A ligand present in MabSelect SuRe). It was found that at low isotherm concentrations the antibody to Protein A ratio was 1:1 and that at intermediate and high concentrations the 2:1 stoichiometry became favoured. The stoichiometry of 3:1 was also tested but was disregarded because of the strong steric effects. The offered approach in this thesis follows the adsorption process in situ, in the column and opens up new prospects to deeper investigation of all modes of chromatography of high industrial relevance, where the understanding of biomolecule–resin mechanism of interaction is of utmost importance.
O mercado de anticorpos monoclonais (mAbs – do inglês monoclonal antibodies) tem vindo a crescer exponencialmente ao longo das últimas décadas devido à elevada capacidade de resposta, selectividade, e robustez destas biomoléculas. O número de áreas de aplicação terapêutica dos mAbs tem também vindo a aumentar, sendo o cancro e as doenças autoimunes as mais representadas. Existem actualmente mais de 50 produtos aprovados e comercializados, representando uma receita de cerca de 100 mil milhões de dólares em vendas. Deste modo, devido à elevada procura e concomitante necessidade de aumento da produção destas biomoléculas, a indústria farmacêutica tem estado em constante evolução e optimização dos processos de produção e purificação de mAbs. Existem ainda critérios cada vez mais apertados para o controlo de qualidade destas biomoléculas por parte das principais agências reguladoras mundiais, nomeadamente a U.S. Food and Drug Administration (FDA) e a Agência Europeia do Medicamento (EMA – do inglês European Medicines Agency), de modo a assegurar a formulação de um produto seguro e de elevada pureza. É, por isso, necessário haver uma compreensão completa de todos os passos envolvidos em toda a cadeia de produção de anticorpos monoclonais. Um dos passos mais críticos, dispendiosos, e limitante é o passo de captura dos anticorpos durante a fase de purificação, nomeadamente o uso de cromatografia de afinidade com resinas de proteína A. A cromatografia de proteína A é o método mais aplicado para a purificação de anticorpos devido à sua elevada selectividade e também devido à sua robustez. As resinas de cromatografia utilizadas têm elevadas capacidades de ligação dinâmica, muito devido ao facto de os seus ligandos serem cadeias com múltiplos locais de ligação. Apesar da ligação dos anticorpos à proteína A ser amplamente conhecida, ainda não existe muita informação acerca do mecanismo através do qual a interação ocorre. Há certos aspectos como a estequiometria, a ligação preferencial, e a orientação tanto da cadeia de proteína A como do anticorpo que ainda não estão muito claros. Este conhecimento pode ser utilizado para optimizar a performance da captura de mAbs, quer seja através do melhoramento das resinas, quer seja através da minimização de custos devido a melhores previsões através do estabelecimento de modelos que incorporem estes parâmetros. Na cromatografia de proteínas são utilizados alguns sensores que têm por base fornecer informação acerca da concentração (UV), pureza (cromatografia de exclusão molecular em HPLC – SEC-HPLC do inglês), potência (ressonância de plasma de superfície – SPR do inglês), e estrutura (dicroísmo circular – CD do inglês e dispersão de luz por ângulo múltiplo – MALS do inglês). No entanto, todos estes sensores recolhem informação após as moléculas terem passado pela coluna de cromatografia operando online no sistema, ou então são usadas offine. Nenhum dos detectores fornece informação sobre a ligação anticorpo-proteína A realmente "in situ". Este trabalho de doutoramento teve como objectivo a compreensão da interacção entre anticorpos e resinas de proteína A com recurso a técnicas de operação in situ, de modo a poder estabelecer um modelo que consiga prever a adsorção de anticorpo, a sua organização estrutural aquando da ligação, a sua migração ao longo da coluna, a sua eluição e consequente pureza e potência. Para tal, foram usadas duas resinas de proteína A comerciais (MabSelect SuRe e TOYOPEARL AF-rProtein A HC) conhecidas pelas suas cadeiras com múltiplos domínios de ligação (4 e 6, respectivamente) e foi utilizado um mAb comercial (trastuzumab). A microcalorimetria de fluxo (FMC – do inglês) foi usada extensivamente para obter os parâmetros termodinâmicos associados à adsorção de anticorpos às resinas de proteína A. O microcalorímetro consiste numa coluna cilíndrica de 6 mm de diâmetro interno e 6 mm de altura com dois sensores térmicos acoplados às paredes da coluna capazes de detectar pequenas variações de potencial durante o processo cromatográfico. O perfil de adsorção mostrou ser de natureza exotérmica com dois passos subjacentes. Um primeiro momento é relativo à ligação em si, que resulta em grandes libertações de calor. Posteriormente, há uma reorganização dos anticorpos nos ligandos de modo a arranjarem a posição energeticamente mais favorável. De modo a caracterizar as alterações estruturais do complexo anticorpo-proteína A e avaliar a sua influência na topologia da superfície na adsorção, foi utilizada a técnica difracção de raios-X de pequeno ângulo (SAXS – do inglês small angle X-ray scattering). Foi usado um pequeno capilar de quartzo transparente aos raios-X em que foram empacotadas as resinas de proteína A. Foi possível acompanhar a formação da camada de anticorpo à superfície das resinas à medida que o anticorpo era introduzido. Foi demonstrada a possibilidade de ligação heterogénea dependendo da saturação da resina. Um modelo aplicado para interpretar os resultados foi o “broken rod model”, que sugere que as moléculas de anticorpo se ligam aos ligandos de proteína A no domínio mais exterior. Uma investigação posterior envolvendo diferentes concentrações de anticorpo foi realizada para avaliar a estequiometria de ligação em diferentes zonas da isotérmica. Os dados experimentais foram comparados com modelos cristalográficos reproduzindo o anticorpo e uma cadeia com quatro domínios de ligação semelhante à usada na resina MabSelect SuRe. Foi verificado que a baixas concentrações a estequiometria mais favorável é de 1:1 e que a concentrações intermédias 2:1 torna-se mais favorável, sendo sempre uma mistura de ambas. A estequimetria 3:1 foi igualmente testada e tida como possível, mas posteriormente desconsiderada como provável devido aos elevados efeitos estéricos presentes, pelo que esta condição carece de uma modelação mais avançada para poder ter em conta a flexibilidade das moléculas. Todos estes resultados confirmam a natureza heterogénea das resinas de proteína A. A abordagem oferecida por esta tese permitiu avaliar in situ a adsorção de anticorpos a proteína A durante o passo cromatográfico de afinidade, no entanto pode ser aplicada a qualquer tipo de cromatografia e para qualquer tipo de biomolécula, permitindo assim, abrir portas a uma investigação mais aprofundada para todos os tipos de cromatografia de alta relevância industrial, onde compreender o mecanismo de ligação biomolécula-ligando é de extrema importância.
