Publicação

Differential regulation of GluN2A- and GluN2B-containing NMDA receptors by BDNF in the plasticity of hippocampal synapses

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os receptores ionotrópicos de glutamato medeiam a maior parte da neurotransmissão excitatória no cérebro e desempenham papéis essenciais na regulação da atividade sináptica. Em particular os receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) desempenham um papel importante em muitas formas de plasticidade sináptica. Esses receptores contêm duas subunidades obrigatórias do tipo GluN1 e duas subunidades reguladoras, na maioria dos casos subunidades do tipo GluN2A e/ou GluN2B. O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um importante regulador da plasticidade sináptica associada a alterações da atividade das sinapses excitatórias no sistema nervoso central dos mamíferos. O BDNF é um mediador da potenciação sináptica de longa duração (LTP) no hipocampo, em parte devido à estimulação da síntese de proteínas responsáveis pela modulação dos NMDAR. Além disso, a fosforilação de Pyk2 mediada por PKC está envolvida na LTP no hipocampo e potencia a actividade dos NMDAR. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesta cascata de reacções. Neste trabalho investigámos o efeito do BDNF na expressão superficial e na dinâmica dos NMDAR contendo subunidades do tipo GluN2A e GluN2B, os quais desempenham um papel fundamental na plasticidade sináptica.O papel do BDNF libertado em resposta ao aumento da actividade neuronal no controlo da excitabilidade neuronal foi demonstrado em registos com múltiplos microeléctrodos em culturas de neurónios do hipocampo estimulados com um bloqueador dos receptores GABAA (bicuculina), um inibidor dos canais de K+ (4-aminopiridina) e com um co-agonista dos NMDAR (glicina). Em seguida foram efectuadas experiências de imunocitoquímica em condição não permeabilizantes, utilizando anticorpos contra sequências extracelulares das subunidades GluN2A e GluN2B dos NMDAR, com o objectivo de avaliar o efeito do BDNF na expressão dos NMDAR na membrana plasmática na sinapse em neurónios do hipocampo em cultura. A incubação com BDNF aumentou a expressão sináptica de ambas as subunidades, ainda que com uma cinética diferente. Verificou-se também que o efeito do BDNF na acumulação sináptica de NMDAR com subunidades GluN2A depende da síntese de proteínas, resultado semelhante ao anteriormente descrito para a regulação das subunidades GluN2B. Além disso, mostrámos que a inibição dos NMDAR contendo subunidades do tipo GluN2B bloqueia completamente o efeito facilitador do BDNF nas sinapses da região CA1 do hipocampo submetidas a estimulação do tipo ‘theta-burst’. A segunda parte do trabalho teve por objectivo investigar os mecanismos de sinalização intracelular responsáveis pela acumulação dos NMDAR na sinapse em resposta à estimulação com BDNF. A supressão dos níveis da cinase de resíduos de tirosina Pyk2 (non-receptor protein proline-rich tyrosine kinase 2) e da proteína de ligação ao RNA hnRNP K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) eliminou os efeitos do BDNF na expressão sináptica dos NMDAR contendo subunidades GluN2A em neurónios do hipocampo em cultura. Estes resultados são semelhantes aos anteriormente descritos para a regulação sináptica das subunidades GluN2B. Além disso, experiências de Western blot mostraram que a fosforilação de Pyk2 induzida por BDNF foi suprimida na presença do inibidor de PKC CÖ6983. Tendo em conta os resultados das experiências de imunocitoquímica acima descritos colocámos a hipótese de que a acumulação sináptica dos NMDAR em resposta à estimulação com BDNF poderia resultar de alterações na dinâmica dos receptores ao nível da membrana plasmática. Para responder a essa questão investigámos a trajectória dos NMDAR contendo subunidades GluN2A e GluN2B ao nível da membrana plasmática, utilizando ‘quantum dots’. A incubação com BDNF reduziu a mobilidade das duas subunidades no compartimento extrassináptico assim como ao nível sináptico. A redução dos níveis da cinase Pyk2 exibiu efeitos opostos sobre a mobilidade de NMDAR contendo GluN2A e GluN2B após estimulação de BDNF. Enquanto a redução dos níveis de PyK2 induziu um aumento da mobilidade na membrana plasmática dos receptores contendo a subunidade GluN2A, o movimento superficial dos NMDAR constituídos pela subunidade GluN2B diminuiu nas mesmas condições. Em conjunto, esses resultados mostram que o BDNF induz a ativação/fosforilação sináptica da cinase Pyk2 por um mecanismo envolvendo a PKC, resultando num aumento da expressão sináptica de NMDAR contendo subunidades GluN2A e GluN2B; este efeito do BDNF foi também mediado pela proteína hnRNP K. Esta via de sinalização pode mediar os efeitos do BDNF na plasticidade sináptica e pode constituir um novo alvo terapêutico para restaurar os déficits cognitivos característicos de várias doenças do cérebro.
Autores principais:	Luca, Pasqualino de
Assunto:	Hipocampo NMDAR BDNF Pyk2 hnRNPK Hippocampus NMDAR BDNF Pyk2 hnRNPK
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Coimbra
Idioma:	inglês
Origem:	Estudo Geral - Universidade de Coimbra