Publicação
Development of genome editing tools for probiotic yeast Saccharomyces boulardii
| Resumo: | Saccharomyces boulardii é uma levedura probiótica que tem sido estudada em vários ensaios clínicos e é usada para tratar doenças intestinais. Esta levedura tem um genoma similar ao de Saccharomyces cerevisiae, mas, a levedura probiótica tem várias diferenças fisiológicas que permitem a sua sobrevivência no trato gastrointestinal (GI). A combinação destas características com o facto desta levedura conseguir produzir proteínas heterólogas fazem de S. boulardii um possível veículo para a entrega de moléculas de interesse no intestino. Sendo uma levedura, S. boulardii pode ser usada para secretar proteínas complexas com modificações pós-traducionais comparáveis às proteínas humanas. Isto é uma vantagem em relação a probióticos de origem bacteriana. A administração deste probiótico pode ser realizada juntamente com antibióticos, de modo a aumentar o tempo de residência no intestino. Assim, esta dissertação focou-se no desenvolvimento de uma estratégia de engenharia genética usando a ferramenta CRISPR-Cas9 de forma a melhorar o potencial probiótico de S. boulardii. Esta tecnologia permite a integração direcionada apenas da cassete de expressão, um fator essencial para o desenvolvimento de suplementos alimentares ou fármacos com aplicações em humanos, onde segurança e precisão são prioritárias. O gene lacA de Aspergillus niger foi escolhido para integração. Este gene codifica para uma proteína que hidrolisa lactose, a β-galactosidase. A entrega desta molécula no intestino tem potencial para ajudar doentes com intolerância à lactose. Através da ferramenta CRISPR Cas9, foram geradas várias estirpes com integrações única e múltiplas que foram caraterizadas em termos de crescimento, perfil metabólico e atividade de β-galactosidase. O impacto da galactose no metabolismo e a capacidade de hidrolisar lactose foram também testadas. A estirpe com três integrações do gene lacA (Sb-Triple) obteve até 11.76 vezes mais atividade quando comparada com as estirpes com apenas uma integração. S. boulardii demonstrou realizar a assimilação de galactose do meio de cultura, mas este açúcar não foi utilizado para crescimento ou para produção de etanol. A estirpe Sb-Triple demonstrou conseguir reter o fenótipo de tolerância ao pH verificado na estirpe selvagem e, além disso, conseguiu hidrolisar lactose proveniente de uma fonte usada na alimentação humana, soro de queijo em pó (CWP). Combinando estas duas características, é possível afirmar que a estirpe Sb-triple tem um potencial probiótico aumentado e que, a estratégia CRISPR-Cas9 implementada neste trabalho, é uma estratégia de engenharia genética viável para a produção de proteínas heterólogas que podem melhorar os efeitos probióticos de S. boulardii. |
|---|---|
| Autores principais: | Carvalho, João Paulo Magalhães de |
| Assunto: | β-galactosidase CRISPR-Cas9 Probióticos Saccharomyces boulardii Probiotics |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
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