Publicação
Desenvolvimento de um procedimento laboratorial de Next Generation Sequencing para ADN de sequenciação inviável pelo método convencional de Sanger
| Resumo: | O aparecimento da engenharia genética contribuiu significativamente e de forma muito concreta para a manipulação do genoma de organismos vivos, levando a importantes descobertas sobre a estrutura do ácido desoxirribonucleico e da descodificação do código genético. Com base nestes avanços e estudos revolucionários posteriormente realizados, é atualmente possível a realização de estudos de sequenciação de ADN em que, com base em métodos bioquímicos se determina a ordem exata das bases nitrogenadas de uma amostra desconhecida. Um dos objetivos deste trabalho foi implementar um protocolo alternativo que permita colmatar as limitações da técnica de Sanger. Para a elaboração deste protocolo, o trabalho englobou a preparação da biblioteca de ADN, foram realizadas otimizações de processos como a fragmentação, amplificação e Size Selection. Para o processo de sequenciação, recorremos à metodologia de sequenciação de segunda geração da Ion Torrent PGM™ System por este ter a capacidade de suportar biliões de reações de sequenciação ao mesmo tempo, a fim de produzir a sequência de bases de uma amostra de interesse. Desta forma tentou-se dar resposta aos casos que não foram possíveis de sequenciar pela tecnologia tradicional de Sanger. Com o resultado deste trabalho demos conta de várias limitações mais típicos que o método de Sanger apresenta e, recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, conseguimos identificar essencialmente problemas de contaminação, amostras de ADN sem sítio específico de ligação do primer à sequência de ADN e de formação de estruturas secundárias. A implementação do protocolo para o uso do Ion Torrent PGM™ System, permitiu assim identificar e estudar as causas de difícil sequenciação de amostras de ADN inviáveis. |
|---|---|
| Autores principais: | Zabolotnya, Oleksandra |
| Assunto: | Engenharia genética Sanger Tecnologias de Sequenciação Next Generation Sequencing Ion Torrent Genetic engineering Sequencing Technologies |
| Ano: | 2017 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade Nova de Lisboa |
| Idioma: | português |
| Origem: | Repositório Institucional da UNL |
| Resumo: | O aparecimento da engenharia genética contribuiu significativamente e de forma muito concreta para a manipulação do genoma de organismos vivos, levando a importantes descobertas sobre a estrutura do ácido desoxirribonucleico e da descodificação do código genético. Com base nestes avanços e estudos revolucionários posteriormente realizados, é atualmente possível a realização de estudos de sequenciação de ADN em que, com base em métodos bioquímicos se determina a ordem exata das bases nitrogenadas de uma amostra desconhecida. Um dos objetivos deste trabalho foi implementar um protocolo alternativo que permita colmatar as limitações da técnica de Sanger. Para a elaboração deste protocolo, o trabalho englobou a preparação da biblioteca de ADN, foram realizadas otimizações de processos como a fragmentação, amplificação e Size Selection. Para o processo de sequenciação, recorremos à metodologia de sequenciação de segunda geração da Ion Torrent PGM™ System por este ter a capacidade de suportar biliões de reações de sequenciação ao mesmo tempo, a fim de produzir a sequência de bases de uma amostra de interesse. Desta forma tentou-se dar resposta aos casos que não foram possíveis de sequenciar pela tecnologia tradicional de Sanger. Com o resultado deste trabalho demos conta de várias limitações mais típicos que o método de Sanger apresenta e, recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, conseguimos identificar essencialmente problemas de contaminação, amostras de ADN sem sítio específico de ligação do primer à sequência de ADN e de formação de estruturas secundárias. A implementação do protocolo para o uso do Ion Torrent PGM™ System, permitiu assim identificar e estudar as causas de difícil sequenciação de amostras de ADN inviáveis. |
|---|