Publicação

Mechanistic insights into bacterial peroxidase from Neisseria gonorrhoeae: biochemical effects of calcium and function of conserved residues

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A gonorreia é uma infeção sexualmente transmissível causada pela Neisseria gonorrhoeae, para a qual ainda não existe vacina, o que demonstra um motivo de grande preocupação, uma vez que esta bactéria demonstrou capacidade para adquirir resistência aos antibióticos atualmente utilizados. Durante a infeção, o sistema imunitário produz espécies reativas de oxigénio como mecanismo de defesa, mas estas bactérias possuem enzimas protetoras, nomeadamente a peroxidase bacteriana, que se encontra no periplasma, onde atua como primeira linha de defesa contra o peróxido de hidrogénio, catalisando-o em água. Esta enzima possui dois hemos c ligados à cadeia polipeptídica: o hemo peroxidático P (centro catalítico) e o hemo E de transferência eletrónica que recebe eletrões de fontes externas, Esta tese teve com objeto de estudo a peroxidase bacteriana de N. gonorrhoeae, com foco: (i) no efeito do cálcio nas propriedades estruturais e catalíticas da enzima, (ii) no papel desempenhado por resíduos conservados na transferência de eletrões entre os hemos E e P (Trp98) e na catálise (Gln108 e Glu118). Variantes destes resíduos (W98A, W98F, Q108A e E118A), produzidas por mutagénese dirigida foram purificadas e caracterizadas bioquímica e espectroscopicamente. Os resultados obtidos mostram que os iões de cálcio são essenciais para que a enzima atinja a sua atividade máxima e para a sua dimerização. No seu estado de valência mista, o cálcio induz uma alteração na coordenação do hemo P, do estado 6sLS do hemo P para o 6sHS, estabilizando a enzima (ΔHunfolding de 600 kJ/mol) e promovendo a dimerização, de acordo com os resultados obtidos por ultracentrifugação analítica. A enzima totalmente ocupada com cálcio apresenta maior afinidade para o H₂O₂ (6,8±0,7 µM) e eficiência catalítica de 2,1 × 10⁷ M⁻¹·s⁻¹, enquanto na presença de EGTA, a enzima é monomérica e inativa, devido à incapacidade de ser ativada, uma vez que o hemo P permanece no estado 6cLS mesmo no estado de valência mista. As variantes W98A, W98F da peroxidase bacteriana de N. gonorrhoeae apresentam estabilidade semelhante à da enzima WT (com Tm de 50±0,1 °C), enquanto a variante E118A demonstra uma menor estabilidade (Tm de 46,4±0,4 °C) e a variante Q108A aparenta apresentar uma estabilidade superior (Tm de 57,6±0,2 °C). As variantes W98A e W98F não são cataliticamente competentes, tendo um V₀ <0,3 µM/min, confirmando assim o papel essencial desempenhado pelo Trp98 na via de transferência de eletrões entre os hemos através de um processo de salto de carga. Verificou-se ainda que o resíduo Glu118 é essencial para a catálise, enquanto a substituição de Gln108 por alanina (Q108A) confere à enzima um KM mais baixo (87± 9µM), e um Vmax mais elevado (176 ±8/min), mas uma eficiência catalítica inferior de 3.4 × 10⁶ M⁻¹·s⁻¹. Este estudo demonstrou também que a enzima Q108A e a WT apresentam atividade dependente do pH com um perfil “bell-shaped” e pKas semelhantes 6,3/6,7 e 8,2/8,6) e um pH ótimo aproximadamente de 7. Em resumo, a NgBCCP depende dos iões de cálcio para estar na sua forma ativa (dímero) e para atingir a atividade máxima, sendo os resíduos conservados Trp98 e Glu118 essenciais para a sua função in vitro, enquanto a Gln108 desempenha provavelmente um papel na orientação do substrato e na estabilização de um estado de transição.
Autores principais:	Leitão , Anita Gonçalves
Assunto:	Neisseria gonorrhoeae reactive oxygen species bacterial peroxidase catalytic mechanism site-directed mutagenesis spectroscopy
Ano:	2025
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade Nova de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório Institucional da UNL