Publicação

Understanding the Gene Regulatory Networks Involved in Sensory Hair Cell Differentiation

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O ouvido interno pode dividir-se em duas partes distintas: o sistema vestibular, responsável pela detecção do movimento e posição, e o sistema auditivo, responsável pela audição. Um dos aspetos mais importantes do ouvido interno é a existência de um padrão celular tipo “tabuleiro de xadrez” nos seus epitélios sensoriais compostos por células ciliadas, no estrato apical, rodeadas basal e lateralmente por células de suporte. As células ciliadas são os mecanorrecetores primários dos nossos sentidos de audição e de equilíbrio, nos vertebrados, transformando os estímulos vibratórios em impulsos elétricos que são transmitidos ao cérebro. No sistema auditivo encontra-se apenas um epitélio sensorial, o órgão de Corti, com uma estrutura celular altamente organizada e precisa, responsável pela capacidade da cóclea detetar e distinguir sons. No entanto, estas células são facilmente destruídas e não existe um mecanismo de regeneração espontâneo em mamíferos, ao contrário de outros vertebrados não-mamíferos. A destruição das células ciliadas é um processo frequente e irreversível que conduz a uma perda de audição definitiva. A perda de audição afecta milhões de pessoas em todo o mundo e é principalmente causada pela perda das células sensoriais ciliadas do ouvido interno. Apesar de no período da infância a medicina regenerativa oferecer soluções terapêuticas para a maioria das perdas de audição, os outros casos ficam limitados ao uso de aparelhos prostéticos que apresentam uma ajuda insuficiente. Sendo que se estima que a perda de audição venha a aumentar devido à poluição sonora e envelhecimento da população, é crescente a necessidade do desenvolvimento de terapias que promovam a regeneração das células ciliadas. Para induzir a regeneração destas células temos que, primeiro, compreender os mecanismos moleculares que regulam a sua diferenciação. Atoh1 é a molécula que tem recebido mais atenção devido à sua capacidade de converter células do ouvido interno não-especializadas em células sensoriais ciliadas. Contudo, a capacidade regenerativa da célula, conferida pela expressão do Atoh1, é ineficaz em cócleas mais envelhecidas/adultas. Investigações recentes permitiram identificar outros factores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento destas células. Um dos factores de transcrição é o Gfi1, que parece desempenhar um papel importante na capacidade do Atoh1 promover o desenvolvimento de células ciliadas. Na sua ausência, Atoh1 é determinante para um destino celular neuronal. Para além do Atoh1, Gfi1 também revelou ser decisivo para que o factor de transcrição Pou4f3 mude a sua actividade de determinante para uma diferenciação neuronal para determinante para uma diferenciação em células sensoriais ciliadas. O Gfi1 parece funcionar como um “interruptor” que ativa o programa de diferenciação das células ciliadas. Nesta tese, exploramos o papel central que o Gfi1 desempenha na modelação da atividade dos outros dois fatores de transcrição, Atoh1 e Pou4f3, e sugerimos que o faz, possivelmente, de duas maneiras distintas: através da repressão da diferenciação neuronal induzida pelo Atoh1 e Pou4f3, e pela promoção da alteração na especificidade do Atoh1 e Pou4f3, permitindo que estes fatores ativem os genes específicos para a diferenciação das células sensoriais ciliadas. Mas, é desconhecido o mecanismo pelo qual o Gfi1 controla este processo. Neste projeto, foi pretendido identificar os mecanismos pelos quais o Gfi1 altera a função do Atoh1 e Pou4f3. Para tal, foi estudada a importância da ligação do Gfi1 com o ADN ou com fatores de transcrição, como o Atoh1 e Pou4f3 e/ou outros co-fatores, cujo recrutamento seja mediado por diferentes regiões do Gfi1. Para tal, foi usada uma nova estratégia in vitro desenvolvida por Aida Costa para a produção de células ciliadas. Esta estratégia envolve a expressão da combinação dos três fatores de transcrição Gfi1-Pou4f3-Atoh1, para programar os progenitores em diferenciação (derivados das células estaminais embrionárias) diretamente em células ciliadas. A ativação conjunta destes fatores in vitro mostrou resultar numa indução de células ciliadas, que expressam marcadores específicos e apresentam estruturas morfologicamente semelhantes aos estereocílios mecanorrecetores. A caracterização in vitro das células ciliadas induzidas foi feita a nível transcricional e morfológico, usando três linhas celulares da combinação dos três factores de transcrição, com variações do Gfi1 em diferentes domínios: 1) Gfi1 sem o domínio “zinc finger” que permite a ligação directa com o ADN; 2) Gfi1 com uma mutação no domínio “SNAG” que destrói a sua capacidade repressora; 3) substituição do Gfi1 pelo Gfi1b, que diferem na região intermédia, entre os dois domínios. Esta caracterização foi feita recorrendo a imuno-citoquímica nas amostras das linhas transgénicas e PCR quantitativo em tempo real, para detetar a expressão de marcadores das células ciliadas e/ou marcadores neuronais. A análise da expressão foi feita comparando as amostras com a linha transgénica contendo um Gfi1 intacto (linha selvagem). De um modo geral, verificou-se que é preciso um Gfi1 intacto para que os marcadores de células ciliadas sejam expressos tal como na linha selvagem. Para aprofundar a nossa investigação, recorremos à funcionalidade do Gfi1 como repressor. O Gfi1 é conhecido por atuar noutros tipos celulares através da interação com proteínas reguladoras da cromatina. Estudos hematopoiéticos mostram que o recrutamento de um complexo LSD1/CoRest/HDACs1-2, pelo domínio SNAG, é essencial para um fenótipo selvagem. Da mesma forma, estudos no laboratório de Sally Lowel revelaram que impedindo a ligação do domínio LSD1, impossibilita a atividade do Gfi1 necessária para induzir a diferenciação de células ciliadas, no sistema usado neste projecto. O recrutamento deste complexo pode ser o mecanismo principal (ou pelo menos um dos mecanismos chave) pelo qual determina a diferenciação de células ciliadas. Usando o mesmo método de análise, foram usados químicos para inibir a função dos domínios LSD1 e HDACs, na linha transgénica selvagem. De um modo geral, observou-se que quanto maior a concentração de inibidor, menor era a expressão de marcadores de células ciliadas. Excepções foram observadas, principalmente nos marcadores específicos para os estereocílios, o que acentua a complexidade dos mecanismos responsáveis por este processo. Estas experiências tiveram um carácter preliminar, mas que permitem identificar os vários desafios a ultrapassar, bem como para o delineamento de futuras experiências, a fim de identificar os eventos-chave da diferenciação regulada pelo Gfi1. Em suma, a caracterização da expressão dos marcadores de células ciliadas/ neuronais, utilizando o nosso sistema de linhas transgénicas, é uma abordagem viável para a investigação do mecanismo de diferenciação das células sensoriais do ouvido interno. Acreditamos que este estudo contribuiu para a aquisição de conhecimentos sobre os processos que possam estar envolvidos no desenvolvimento de células ciliadas.
Autores principais:	Galego, Catarina Romão
Assunto:	Gfi1 Células sensoriais ciliadas Ouvido interno Regeneração Células estaminais embrionárias Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O ouvido interno pode dividir-se em duas partes distintas: o sistema vestibular, responsável pela detecção do movimento e posição, e o sistema auditivo, responsável pela audição. Um dos aspetos mais importantes do ouvido interno é a existência de um padrão celular tipo “tabuleiro de xadrez” nos seus epitélios sensoriais compostos por células ciliadas, no estrato apical, rodeadas basal e lateralmente por células de suporte. As células ciliadas são os mecanorrecetores primários dos nossos sentidos de audição e de equilíbrio, nos vertebrados, transformando os estímulos vibratórios em impulsos elétricos que são transmitidos ao cérebro. No sistema auditivo encontra-se apenas um epitélio sensorial, o órgão de Corti, com uma estrutura celular altamente organizada e precisa, responsável pela capacidade da cóclea detetar e distinguir sons. No entanto, estas células são facilmente destruídas e não existe um mecanismo de regeneração espontâneo em mamíferos, ao contrário de outros vertebrados não-mamíferos. A destruição das células ciliadas é um processo frequente e irreversível que conduz a uma perda de audição definitiva. A perda de audição afecta milhões de pessoas em todo o mundo e é principalmente causada pela perda das células sensoriais ciliadas do ouvido interno. Apesar de no período da infância a medicina regenerativa oferecer soluções terapêuticas para a maioria das perdas de audição, os outros casos ficam limitados ao uso de aparelhos prostéticos que apresentam uma ajuda insuficiente. Sendo que se estima que a perda de audição venha a aumentar devido à poluição sonora e envelhecimento da população, é crescente a necessidade do desenvolvimento de terapias que promovam a regeneração das células ciliadas. Para induzir a regeneração destas células temos que, primeiro, compreender os mecanismos moleculares que regulam a sua diferenciação. Atoh1 é a molécula que tem recebido mais atenção devido à sua capacidade de converter células do ouvido interno não-especializadas em células sensoriais ciliadas. Contudo, a capacidade regenerativa da célula, conferida pela expressão do Atoh1, é ineficaz em cócleas mais envelhecidas/adultas. Investigações recentes permitiram identificar outros factores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento destas células. Um dos factores de transcrição é o Gfi1, que parece desempenhar um papel importante na capacidade do Atoh1 promover o desenvolvimento de células ciliadas. Na sua ausência, Atoh1 é determinante para um destino celular neuronal. Para além do Atoh1, Gfi1 também revelou ser decisivo para que o factor de transcrição Pou4f3 mude a sua actividade de determinante para uma diferenciação neuronal para determinante para uma diferenciação em células sensoriais ciliadas. O Gfi1 parece funcionar como um “interruptor” que ativa o programa de diferenciação das células ciliadas. Nesta tese, exploramos o papel central que o Gfi1 desempenha na modelação da atividade dos outros dois fatores de transcrição, Atoh1 e Pou4f3, e sugerimos que o faz, possivelmente, de duas maneiras distintas: através da repressão da diferenciação neuronal induzida pelo Atoh1 e Pou4f3, e pela promoção da alteração na especificidade do Atoh1 e Pou4f3, permitindo que estes fatores ativem os genes específicos para a diferenciação das células sensoriais ciliadas. Mas, é desconhecido o mecanismo pelo qual o Gfi1 controla este processo. Neste projeto, foi pretendido identificar os mecanismos pelos quais o Gfi1 altera a função do Atoh1 e Pou4f3. Para tal, foi estudada a importância da ligação do Gfi1 com o ADN ou com fatores de transcrição, como o Atoh1 e Pou4f3 e/ou outros co-fatores, cujo recrutamento seja mediado por diferentes regiões do Gfi1. Para tal, foi usada uma nova estratégia in vitro desenvolvida por Aida Costa para a produção de células ciliadas. Esta estratégia envolve a expressão da combinação dos três fatores de transcrição Gfi1-Pou4f3-Atoh1, para programar os progenitores em diferenciação (derivados das células estaminais embrionárias) diretamente em células ciliadas. A ativação conjunta destes fatores in vitro mostrou resultar numa indução de células ciliadas, que expressam marcadores específicos e apresentam estruturas morfologicamente semelhantes aos estereocílios mecanorrecetores. A caracterização in vitro das células ciliadas induzidas foi feita a nível transcricional e morfológico, usando três linhas celulares da combinação dos três factores de transcrição, com variações do Gfi1 em diferentes domínios: 1) Gfi1 sem o domínio “zinc finger” que permite a ligação directa com o ADN; 2) Gfi1 com uma mutação no domínio “SNAG” que destrói a sua capacidade repressora; 3) substituição do Gfi1 pelo Gfi1b, que diferem na região intermédia, entre os dois domínios. Esta caracterização foi feita recorrendo a imuno-citoquímica nas amostras das linhas transgénicas e PCR quantitativo em tempo real, para detetar a expressão de marcadores das células ciliadas e/ou marcadores neuronais. A análise da expressão foi feita comparando as amostras com a linha transgénica contendo um Gfi1 intacto (linha selvagem). De um modo geral, verificou-se que é preciso um Gfi1 intacto para que os marcadores de células ciliadas sejam expressos tal como na linha selvagem. Para aprofundar a nossa investigação, recorremos à funcionalidade do Gfi1 como repressor. O Gfi1 é conhecido por atuar noutros tipos celulares através da interação com proteínas reguladoras da cromatina. Estudos hematopoiéticos mostram que o recrutamento de um complexo LSD1/CoRest/HDACs1-2, pelo domínio SNAG, é essencial para um fenótipo selvagem. Da mesma forma, estudos no laboratório de Sally Lowel revelaram que impedindo a ligação do domínio LSD1, impossibilita a atividade do Gfi1 necessária para induzir a diferenciação de células ciliadas, no sistema usado neste projecto. O recrutamento deste complexo pode ser o mecanismo principal (ou pelo menos um dos mecanismos chave) pelo qual determina a diferenciação de células ciliadas. Usando o mesmo método de análise, foram usados químicos para inibir a função dos domínios LSD1 e HDACs, na linha transgénica selvagem. De um modo geral, observou-se que quanto maior a concentração de inibidor, menor era a expressão de marcadores de células ciliadas. Excepções foram observadas, principalmente nos marcadores específicos para os estereocílios, o que acentua a complexidade dos mecanismos responsáveis por este processo. Estas experiências tiveram um carácter preliminar, mas que permitem identificar os vários desafios a ultrapassar, bem como para o delineamento de futuras experiências, a fim de identificar os eventos-chave da diferenciação regulada pelo Gfi1. Em suma, a caracterização da expressão dos marcadores de células ciliadas/ neuronais, utilizando o nosso sistema de linhas transgénicas, é uma abordagem viável para a investigação do mecanismo de diferenciação das células sensoriais do ouvido interno. Acreditamos que este estudo contribuiu para a aquisição de conhecimentos sobre os processos que possam estar envolvidos no desenvolvimento de células ciliadas.