Publicação

Bacteriocins of commensal bacteria as targeted antimicrobials to control pneumococcal colonization

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Streptococcus pneumoniae é uma bactéria que coloniza assintomaticamente o trato respiratório superior humano, nomeadamente a nasofaringe e a orofaringe. É considerado um patobionte, uma vez que pode causar uma série de infeções como pneumonia, meningite e bacteriemia, particularmente em crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos. A emergência e disseminação de clones resistentes a vários antibióticos têm elevado a dificuldade de tratamento desta bactéria. Várias vacinas que têm como alvo a sua cápsula (o maior fator de virulência) já foram criadas e introduzidas no plano nacional de vacinação de vários países. No entanto, apenas são específicas contra alguns serotipos. Assim, S. pneumoniae continua a estar associado com altas taxas de morbilidade e mortalidade no mundo. Têm sido testadas várias estratégias para controlar bactérias resistentes a antibióticos usados tipicamente na clínica. Uma dessas estratégias apropria armas antimicrobianas produzidas por bactérias que co-colonizam o mesmo nicho do patogénico de interesse. Estes pequenos péptidos, ou bacteriocinas, têm frequentemente como alvo outras bactérias semelhantes ao produtor e podem ser uma fonte de novos terapêuticos para controlar S. pneumoniae. No trato respiratório superior, várias bactérias comensais do género Streptococcus colonizam os mesmos nichos que S. pneumoniae, nomeadamente Streptococcus oralis and Streptococcus mitis. S. mitis tem sido estudada em mais detalhe nos últimos anos, e vários loci de síntese bacteriocinas foram descritos. Anteriormente a este trabalho, o laboratório identificou sete comensais pertencentes a estas espécies com um grande potencial inibitório contra o pneumococo. Estas estirpes foram sequenciadas, tendo sido encontrados vários loci de produção de bacteriocinas que poderiam mediar esta inibição. Para o presente estudo, focámo-nos num tipo de locus que ainda não foi descrito em detalhe em S. mitis. Além disso, este locus não foi descrito em S. pneumoniae, sendo menos provável que este tenha um mecanismo de imunidade contra estas bacteriocinas. Começámos por analisar a estrutura dos loci e vimos que estes variavam em complexidade. Todos eles eram compostos pelos genes que codificam para o transportador ComAB e pelo menos uma região de bacteriocinas e proteínas de imunidade. Outros continham proteínas de ligação à colina, peptidases C40, um sistema de transdução de sinal de dois componentes e genes que codificam recombinases/integrases. O transportador ComAB é comum a várias espécies de Streptococcus e sabe-se que tem um papel importante na exportação e maturação da feromona ComC, levando à ativação da competência. Para percebermos se estas bacteriocinas seriam expressas durante o período de competência, procurámos promotores descritos previamente, que são induzidos durante a fase inicial e tardia da competência (ComE-box- fase inicial; SigX-box- fase tardia). Encontrámos uma região ComE-box a montante de comAB em todas as estirpes. Além disso, foram encontrados vários SigX-box a montante de genes que codificam bacteriocinas, proteínas de imunidade e outras proteínas hipotéticas. Curiosamente, várias regiões promotoras SigX-box estavam presentes a montante de um único gene ou operão. Este resultado sugere a existência de artefactos de eventos de recombinação sucessivos ou um mecanismo de maximização de transcrição do locus durante a competência. Para continuar este trabalho, concentrámo-nos numa das estirpes de S. mitis cujo locus continha bacteriocinas que estavam ausentes nas outras estirpes, e que estavam precedidas por cinco SigX-boxes. Para analisar o papel destas bacteriocinas na inibição de S. pneumoniae causada por esta estirpe, criámos um mutante em que a região dos genes das bacteriocinas e proteínas de imunidade foi substituídas por um marcador de resistência à canamicina. A inibição da estirpe selvagem e do mutante foi testada contra 47 isolados de S. pneumoniae por dois ensaios. Um deles permite contacto celular entre S. mitis e S. pneumoniae, e outro utiliza a difusão no agar de sobrenadante do crescimento planctónico das duas estirpes. As experiências que permitem contacto celular, ou overlay assays, revelaram que a estirpe mutante levava à formação de halos maiores do que a selvagem. Para perceber o que contribuía para este efeito, testámos a viabilidade celular e a taxa de crescimento das duas estirpes em meio planctónico. A mutante tinha maior número de células viáveis quando numa cultura com densidade ótica igual à da selvagem. Para controlar para as diferenças de viabilidade nas duas culturas, nas seguintes experiências ajustámos a densidade ótica até à qual crescíamos cada estirpe, para que tivessem o mesmo número de células. Na experiência em que testámos os sobrenadantes da estirpe selvagem e mutante contra os isolados de S. pneumoniae, vimos uma pequena redução do fenótipo de inibição da estirpe mutante. No entanto, as diferenças na inibição foram pequenas, e a mutante ainda conseguia inibir os 47 isolados. Para confirmar que estas bacteriocinas são expressas durante a competência, testámos os sobrenadantes das duas estirpes crescidas a dois valores de pH. Um deles é permissivo para o desenvolvimento da competência (pH 7.5), enquanto que o outro não o permite (pH 6.5). Vimos que o perfil inibitório da estirpe selvagem quando crescida a pH 6.5 era semelhante ao perfil da mutante a pH 7.5 ou pH 6.5. Para testar se, apesar destas diferenças de viabilidade e perfil inibitório da mutante, este locus teria outra função biológica, quantificámos a viabilidade celular e quantidade de DNA extracelular (eDNA) no biofilme. Já foi demonstrado que a libertação de DNA por uma subpopulação das células durante o estado de competência pode ser um mecanismo importante que leva à disponibilização de DNA que as estirpes utilizam para recombinar. Em ensaios de crescimento em biofilme de 24 horas descobrimos que tal como em meio planctónico, a selvagem tem uma menor viabilidade celular. No entanto, os seus biofilmes são aproximadamente 30×mais ricos em eDNA. Em conclusão, este estudo reporta um tipo de locus de bacteriocinas presentes em comensais do género Streptococcus que parece ser expresso em condições de competência. Demonstrámos que um mutante de deleção para estas bacteriocinas não altera muito o seu perfil inibitório contra o pneumococo, mas leva a alterações drásticas na sua viabilidade em meio planctónico e em biofilme. No entanto, a quantidade de eDNA da estirpe selvagem na sua matriz de biofilme é muito superior à da mutante. A função biológica deste locus pode estar associada com um mecanismo alternativo de fratricídio durante o período de competência. Neste caso, uma subpopulação seria morta durante este período, libertando o seu DNA que, pode ser adquirido por células vivas para recombinação, mas também poderia ser utilizado como fonte de alimento, ou para a formação de um biofilme mais robusto.
Autores principais:	Borralho, João Pedro Mestre
Assunto:	Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis Bacteriocinas Competência DNA externo Teses de mestrado - 2021
Ano:	2021
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Streptococcus pneumoniae é uma bactéria que coloniza assintomaticamente o trato respiratório superior humano, nomeadamente a nasofaringe e a orofaringe. É considerado um patobionte, uma vez que pode causar uma série de infeções como pneumonia, meningite e bacteriemia, particularmente em crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos. A emergência e disseminação de clones resistentes a vários antibióticos têm elevado a dificuldade de tratamento desta bactéria. Várias vacinas que têm como alvo a sua cápsula (o maior fator de virulência) já foram criadas e introduzidas no plano nacional de vacinação de vários países. No entanto, apenas são específicas contra alguns serotipos. Assim, S. pneumoniae continua a estar associado com altas taxas de morbilidade e mortalidade no mundo. Têm sido testadas várias estratégias para controlar bactérias resistentes a antibióticos usados tipicamente na clínica. Uma dessas estratégias apropria armas antimicrobianas produzidas por bactérias que co-colonizam o mesmo nicho do patogénico de interesse. Estes pequenos péptidos, ou bacteriocinas, têm frequentemente como alvo outras bactérias semelhantes ao produtor e podem ser uma fonte de novos terapêuticos para controlar S. pneumoniae. No trato respiratório superior, várias bactérias comensais do género Streptococcus colonizam os mesmos nichos que S. pneumoniae, nomeadamente Streptococcus oralis and Streptococcus mitis. S. mitis tem sido estudada em mais detalhe nos últimos anos, e vários loci de síntese bacteriocinas foram descritos. Anteriormente a este trabalho, o laboratório identificou sete comensais pertencentes a estas espécies com um grande potencial inibitório contra o pneumococo. Estas estirpes foram sequenciadas, tendo sido encontrados vários loci de produção de bacteriocinas que poderiam mediar esta inibição. Para o presente estudo, focámo-nos num tipo de locus que ainda não foi descrito em detalhe em S. mitis. Além disso, este locus não foi descrito em S. pneumoniae, sendo menos provável que este tenha um mecanismo de imunidade contra estas bacteriocinas. Começámos por analisar a estrutura dos loci e vimos que estes variavam em complexidade. Todos eles eram compostos pelos genes que codificam para o transportador ComAB e pelo menos uma região de bacteriocinas e proteínas de imunidade. Outros continham proteínas de ligação à colina, peptidases C40, um sistema de transdução de sinal de dois componentes e genes que codificam recombinases/integrases. O transportador ComAB é comum a várias espécies de Streptococcus e sabe-se que tem um papel importante na exportação e maturação da feromona ComC, levando à ativação da competência. Para percebermos se estas bacteriocinas seriam expressas durante o período de competência, procurámos promotores descritos previamente, que são induzidos durante a fase inicial e tardia da competência (ComE-box- fase inicial; SigX-box- fase tardia). Encontrámos uma região ComE-box a montante de comAB em todas as estirpes. Além disso, foram encontrados vários SigX-box a montante de genes que codificam bacteriocinas, proteínas de imunidade e outras proteínas hipotéticas. Curiosamente, várias regiões promotoras SigX-box estavam presentes a montante de um único gene ou operão. Este resultado sugere a existência de artefactos de eventos de recombinação sucessivos ou um mecanismo de maximização de transcrição do locus durante a competência. Para continuar este trabalho, concentrámo-nos numa das estirpes de S. mitis cujo locus continha bacteriocinas que estavam ausentes nas outras estirpes, e que estavam precedidas por cinco SigX-boxes. Para analisar o papel destas bacteriocinas na inibição de S. pneumoniae causada por esta estirpe, criámos um mutante em que a região dos genes das bacteriocinas e proteínas de imunidade foi substituídas por um marcador de resistência à canamicina. A inibição da estirpe selvagem e do mutante foi testada contra 47 isolados de S. pneumoniae por dois ensaios. Um deles permite contacto celular entre S. mitis e S. pneumoniae, e outro utiliza a difusão no agar de sobrenadante do crescimento planctónico das duas estirpes. As experiências que permitem contacto celular, ou overlay assays, revelaram que a estirpe mutante levava à formação de halos maiores do que a selvagem. Para perceber o que contribuía para este efeito, testámos a viabilidade celular e a taxa de crescimento das duas estirpes em meio planctónico. A mutante tinha maior número de células viáveis quando numa cultura com densidade ótica igual à da selvagem. Para controlar para as diferenças de viabilidade nas duas culturas, nas seguintes experiências ajustámos a densidade ótica até à qual crescíamos cada estirpe, para que tivessem o mesmo número de células. Na experiência em que testámos os sobrenadantes da estirpe selvagem e mutante contra os isolados de S. pneumoniae, vimos uma pequena redução do fenótipo de inibição da estirpe mutante. No entanto, as diferenças na inibição foram pequenas, e a mutante ainda conseguia inibir os 47 isolados. Para confirmar que estas bacteriocinas são expressas durante a competência, testámos os sobrenadantes das duas estirpes crescidas a dois valores de pH. Um deles é permissivo para o desenvolvimento da competência (pH 7.5), enquanto que o outro não o permite (pH 6.5). Vimos que o perfil inibitório da estirpe selvagem quando crescida a pH 6.5 era semelhante ao perfil da mutante a pH 7.5 ou pH 6.5. Para testar se, apesar destas diferenças de viabilidade e perfil inibitório da mutante, este locus teria outra função biológica, quantificámos a viabilidade celular e quantidade de DNA extracelular (eDNA) no biofilme. Já foi demonstrado que a libertação de DNA por uma subpopulação das células durante o estado de competência pode ser um mecanismo importante que leva à disponibilização de DNA que as estirpes utilizam para recombinar. Em ensaios de crescimento em biofilme de 24 horas descobrimos que tal como em meio planctónico, a selvagem tem uma menor viabilidade celular. No entanto, os seus biofilmes são aproximadamente 30×mais ricos em eDNA. Em conclusão, este estudo reporta um tipo de locus de bacteriocinas presentes em comensais do género Streptococcus que parece ser expresso em condições de competência. Demonstrámos que um mutante de deleção para estas bacteriocinas não altera muito o seu perfil inibitório contra o pneumococo, mas leva a alterações drásticas na sua viabilidade em meio planctónico e em biofilme. No entanto, a quantidade de eDNA da estirpe selvagem na sua matriz de biofilme é muito superior à da mutante. A função biológica deste locus pode estar associada com um mecanismo alternativo de fratricídio durante o período de competência. Neste caso, uma subpopulação seria morta durante este período, libertando o seu DNA que, pode ser adquirido por células vivas para recombinação, mas também poderia ser utilizado como fonte de alimento, ou para a formação de um biofilme mais robusto.