Publicação
Genome-wide profiling of RNA polymerase II and associated co-transcriptional processes using advanced NET-seq data
| Resumo: | A transcrição é o processo, presente em todos os seres vivos, em que a partir de uma cadeia molde de DNA se sintetiza uma cadeia complementar de RNA. A grande maioria dos genes em eucariotas é transcrita pela RNA polimerase II. A cadeia de RNA sintetizada não é, no entanto, o produto final, já que pode ser alvo de vários tipos de processamento, como splicing, poliadenilação ou edição de bases. Estes fenómenos foram já descritos como ocorrendo co ou pós-transcricionalmente. No entanto, não são ainda conhecidos todos os componentes, nem como são regulados estes processos ou qual a sua interação com a RNA polimerase II, em particular com o seu domínio carboxi-terminal (CTD). Para abordar estes problemas de uma forma não enviesada, optou-se por adaptar uma técnica anteriormente descrita, que abrange todo o genoma, de alto rendimento e precisão, a native elongating transcript sequencing (NET-seq); sendo ela modificada de modo a poder detetar qual o estado de fosforilação do domínio carboxi-terminal da polimerase isolada em cada ensaio. Ao novo protocolo chamou-se advanced NET-seq (ANET-seq). Para além dos dados gerados por este protocolo, foram também obtidos dados de RNA ligado à fração de cromatina (ChrRNA). Todos os dados foram obtidos de células HeLa, sendo esta a primeira instância em que um estudo de nível genómico com esta precisão de mapeamento foi aplicado em mamíferos. Análise inicial destes dados revelou uma distribuição das isoformas do CTD nos genes idêntica ao previamente descrito por outras técnicas. Adicionalmente, verificou-se também a captura de precursores do splicing, nomeadamente do 3’ do exão upstream, distintamente nos casos em que este é incluído no transcrito final. Estes exões aparecem principalmente associados a polimerase fosforilada na serina 5 do seu CTD. Outra observação curiosa foi a deteção de precursores do processamento de micro RNAs pelo complexo Drosha/DGCR8. Diferenças na deteção destes precursores permitiu postular diferentes dinâmicas para o processamento destes RNAs não codificantes. Também se obtiveram dados de ANET-seq (com anticorpo para fosforilação da serina 2) e ChrRNA de células HeLa transfetadas com siRNA contra fatores de terminação – Xrn2 – e processamento do terminal 3’ do pre-mRNA – CPSF73 e CstF64+CstF64τ. Análise destes dados permitiu concluir que os fatores de processamento, mas não o Xrn2, influenciam significativamente a dinâmica da polimerase na região 3’ do gene, no final da transcrição, promovendo a sua pausa e subsequente desassociação do DNA. Constatou-se também que estes fatores afetam a acumulação de polimerase junto ao promotor dos genes, afetando igualmente a produção de transcritos upstream do promotor (PROMPTs), podendo concluir-se que estes fatores participam na regulação da transcrição não-produtiva. Os resultados obtidos foram satisfatórios e também surpreendentes. Com este trabalho, é apresentada uma nova forma de estudar, ao nível do genoma, como ocorre a regulação da transcrição pelo CTD. Mostram-se também novas provas sobre processamento cotranscricional do RNA e a sua ligação à fosforilação do CTD. Foram igualmente elucidados os papéis de alguns fatores envolvidos na fase final da transcrição. Finalmente, ficou outra vez demonstrada a importância de estudos abrangentes na área da transcrição, em complemento dos trabalhos moleculares e bioquímicos já desenvolvidos há décadas. Esperase, de futuro, um aprofundamento das técnicas de alto rendimento, e uma consequente adequação das ferramentas bioinformáticas a estes estudos. |
|---|---|
| Autores principais: | Gomes, Tomás Pires de Carvalho |
| Assunto: | Transcrição ANET-seq Sequenciação de RNA CTD Splicing Micro RNA Clivagem e poliadenilação Terminação Teses de mestrado - 2014 |
| Ano: | 2014 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
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