Publicação

Characterization of the mechanisms that underlie karyotypic evolution

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A manutenção de um cariótipo estável é fundamental para a integridade celular, especialmente nas células da linha germinativa, onde a estabilidade genética assegura a transmissão fiel da informação genética ao longo das gerações. Alterações nesse equilíbrio podem comprometer a saúde e a viabilidade das gerações subsequentes. As alterações cromossómicas dividem-se em duas categorias: estruturais e numéricas. As alterações estruturais envolvem mudanças na arquitetura dos cromossomas, como deleções, duplicações, inversões ou translocações. Já as alterações numéricas referem-se a variações no número de cromossomas, que podem ocorrer por perda ou ganho de cromossomas individuais (aneuploidia) ou de conjuntos inteiros (poliploidia). Uma forma comum de poliploidia é a duplicação total do genoma (DTG), resultante de disrupções no ciclo celular. Este fenómeno pode ocorrer devido à endoreplicação (duplicação do DNA sem divisão celular), saída da mitose sem segregação cromossómica (mitotic slippage) ou falha na citocinese. A DTG pode surgir em diversos tipos celulares e tecidos específicos durante o desenvolvimento, sendo um fator relevante na especiação de alguns organismos. Contudo, também é uma característica relevante no desenvolvimento de vários tipos de cancro, sendo identificada em mais de 30% dos tumores humanos, independentemente do estadio do tumor. Assim, compreender os mecanismos que estão na origem destas alterações cromossómicas e como as células se adaptam a elas, é crucial tanto no âmbito do conhecimento básico como numa perspetiva mais aplicada, tendo implicações significativas na área clínica. O muntjac indiano (Muntiacus muntjak), uma espécie de cervídeo, destaca-se por possuir o menor número de cromossomas conhecido entre os mamíferos placentários, com apenas seis cromossomas nas fêmeas e sete nos machos. Esta realidade, aliada ao facto de a função da maioria das proteínas importantes durante a mitose ser conservada em relação aos humanos, faz do Muntiacus muntjak um modelo único e valioso para o estudo de fenómenos relacionados com a divisão celular e a estabilidade cromossómica. Em condições de cultura in vitro, os fibroblastos de Muntjac Indiano frequentemente experimentam alterações cariotípicas espontâneas, passando de estados diploides para triploides e tetraploides à medida que a cultura se prolonga no tempo. Esta capacidade natural de poliploidização, sem a necessidade de indução artificial, oferece uma oportunidade única para observar a evolução cariotípica em tempo real, sem os efeitos colaterais provocados por perturbações externas. Por esta razão, os fibroblastos de Muntjac Indiano constituem um modelo ideal para investigar os mecanismos subjacentes à DTG e à evolução do cariótipo. No presente estudo, analisámos de forma detalhada a dinâmica da evolução cariotípica em fibroblastos de Muntjac Indiano ao longo do tempo. Através de técnicas avançadas, como a citometria de fluxo e a análise do cariótipo por imunofluorescência (chromossome spreads), observámos uma redução significativa da população diploide ao longo do tempo, acompanhada por um aumento das células tetraploides, enquanto a população triploide permaneceu relativamente constante. Estes resultados sugerem que as células diploides podem estar a contribuir para a formação de células tetraploides, possivelmente como resultado de erros na divisão celular que impeçam a segregação do material genético. Para testar esta hipótese, isolámos populações maioritariamente diploides ou tetraploides e monitorizámos a sua evolução durante aproximadamente dois meses. Após esse período, observámos alterações notáveis na distribuição cariotípica. Na população inicialmente diploide, registou-se uma diminuição das células diploides e triploides, com um aumento das células tetraploides. Em conformidade, a população tetraploide demonstrou uma diminuição das células diploides, acompanhada por um aumento das células triploides e tetraploides. A evolução da população diploide corroborou com a nossa hipótese inicial, evidenciando uma contribuição clara para a formação de células tetraploides. No entanto, a análise da população tetraploide levou-nos à formulação de duas hipóteses sobre a origem das células triploides. A primeira hipótese sugere que as células diploides podem originar tanto células triploides quanto tetraploides, sendo que, à medida que as células tetraploides atingem um tamanho específico, a formação de células triploides torna-se mais favorecida. A segunda hipótese propõe que as células tetraploides, após uma divisão celular inadequada, dão origem a duas células filhas com números de cromossomas diferentes, o que resulta na formação de células triploides. Dado que ambas as hipóteses sugerem que o aumento de ploidia poderá resultar de falhas no processo de divisão celular, decidimos prosseguir com uma análise mais aprofundada destes eventos através de microscopia de células fixadas e vivas. Esta abordagem permitiu-nos observar fenótipos consistentes com defeitos mitóticos, como a saída da mitose sem segregação cromossómica (mitotic slippage) e a presença de fusos multipolares, indicando que erros durante a mitose podem desempenhar um papel central na poliploidização espontânea em fibroblastos de Muntjac Indiano. Em seguida, investigámos os fatores-chave que influenciam a evolução cariotípica dos fibroblastos de Muntjac Indiano em cultura e identificámos as condições que favorecem a manutenção, ou até o enriquecimento, da população diploide. Para este fim, mantivemos os fibroblastos em cultura durante cerca de dois meses na presença de diferentes composições de meio, concentrações de soro e substratos extracelulares, e avaliamos o impacto destas variáveis na distribuição cariotípica. Para analisar o impacto da composição do meio e da concentração de soro, delineámos duas experiências. Na primeira, os fibroblastos foram inicialmente cultivados no meio padrão utilizado no laboratório (MEM suplementado com 10% de FBS) e, após o enriquecimento da população diploide, foram expostos a diferentes meios e concentrações de soro. Na segunda abordagem, as células foram diretamente expostas a diversas condições de meio e soro desde o início, antes do enriquecimento e posterior análise da evolução cariotípica. Através destas experiências, descobrimos que tanto a composição do meio como a concentração de soro influenciam significativamente a manutenção do cariótipo. Identificámos um meio (F10), mais rico em nutrientes, que promove a manutenção e o enriquecimento da população diploide. Para testar se este meio teria a capacidade de reverter a poliploidização, transferimos uma população maioritariamente tetraploide, cultivada anteriormente em MEM, para o meio F10. Após dois meses de cultura, observámos um aumento significativo na população diploide e uma redução nas populações triploide e tetraploide. Em contraste, o grupo controlo, cultivado em MEM, apresentou uma diminuição nas populações diploide e tetraploide. Com base nestes resultados, existem duas possibilidades para explicar o enriquecimento em células diploides: o meio mais rico em nutrientes (F10) pode permitir uma maior fidelidade na divisão celular ou conferir uma vantagem proliferativa para as células diploides em detrimento de outros cariótipos. Em suma, estes resultados sugerem que a escolha do meio de cultura pode influenciar a distribuição do cariótipo e a manutenção, a longo prazo, de populações diploides em culturas de fibroblastos de Muntjac Indiano. Adicionalmente, explorámos se o uso de diferentes matrizes extracelulares poderia influenciar a evolução cariotípica dos fibroblastos de Muntjac Indiano. Para tal, cultivámos estas células em frascos revestidos com laminina, colagénio e fibronectina durante cerca de dois meses. Os resultados indicaram que a cultura em substratos de matriz extracelular não provocou alterações cariotípicas significativas. Contudo, observámos variações na taxa de proliferação e no crescimento celular. A nossa hipótese é que, dado que os fibroblastos são capazes de produzir e secretar a sua própria matriz extracelular, esta capacidade pode mascarar possíveis efeitos destas matrizes. Em conclusão, a investigação sobre a evolução cariotípica em fibroblastos de Muntjac Indiano fornece pistas valiosas sobre os mecanismos que estão na origem da DTG, abrindo portas para uma melhor compreensão dos processos envolvidos na progressão tumoral, onde a poliploidização é frequentemente associada à instabilidade genética e à evolução do cancro. O modelo Muntjac Indiano, com a sua predisposição natural para a poliploidização, constitui uma plataforma única para estudar os mecanismos moleculares que promovem a DTG e, potencialmente, explorar novas abordagens terapêuticas que previnam ou revertam este fenómeno.
Autores principais:	Rodrigues, Beatriz dos Reis
Assunto:	Evolução Cariótipica Duplicação Total do Genoma (DTG) Muntjac Indiano (MI) Instabilidade Cromossómica Mitose Teses de mestrado - 2024
Ano:	2024
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa