Publicação

Study of gut permeability in patients with Systemic Lupus Erythematosus

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O lúpus eritematoso sistémico é uma doença imunomediada complexa, caracterizada por uma elevada diversidade de manifestações clínicas e por períodos de remissão e recidiva. Esta doença pode afetar a maioria dos órgãos e tecidos do corpo humano, com maior enfâse na pele, músculos e articulações, mas também nos rins e no sistema nervoso. Apesar do enorme esforço por parte da comunidade científica, a sua etiologia ainda não é totalmente compreendida. No entanto, sabe-se que fatores genéticos e ambientais contribuem para o seu desenvolvimento, despoletando uma desregulação do sistema imunitário, caracterizada pela perda de tolerância a autoantigénios, sobreativação de linfócitos e produção de autoanticorpos e de citocinas pró-inflamatórias. Esta doença afeta principalmente mulheres em idade fértil. No entanto, o lúpus na criança e no adolescente, apesar de ser mais raro do que em idade adulta, é geralmente uma doença com uma apresentação clínica mais grave, com maior atingimento renal e do sistema nervoso central. Apesar dos vários progressos em termos de diagnóstico e tratamento, o lúpus eritematoso sistémico continua a ter uma elevada taxa de morbilidade e mortalidade. Estudos recentes concluíram que a microbiota intestinal tem um papel preponderante na patogénese de várias doenças imunomediadas, incluindo o lúpus eritematoso sistémico. A microbiota intestinal é constituída por milhões de microorganismos que são essenciais para a proteção contra patogénios invasores e para a regulação da resposta imune inata e adaptativa. Em doentes com lúpus eritematoso sistémico observou-se uma alteração da diversidade da microbiota intestinal, com decréscimo no rácio Firmicutes/Bacteroidetes comparativamente com controlos saudáveis, característica que também foi observada em outras doenças autoimunes. Existe uma relação muito próxima entre a microbiota intestinal e a homeostasia da mucosa intestinal. Pensa-se que os microrganismos comensais influenciam as proteínas da barreira intestinal, alterando a sua permeabilidade, através dos seus efeitos nas junções intercelulares. Desta forma, a disbiose intestinal potencia um leaky gut que pode favorecer a passagem de microrganismos, dos seus componentes e metabolitos para a circulação sanguínea, contribuindo para a sobreativação do sistema imunitário e para a cronicidade do lúpus eritematoso sistémico. Em modelo roedor de lúpus, verificou-se que a translocação de um patogénio intestinal para o fígado e outros tecidos levava a doença e morte em animais geneticamente predispostos para a autoimunidade. Desta forma, a translocação de patogénios através de uma barreira intestinal comprometida aparenta despoletar a autoimunidade sistémica característica do lúpus, o que demonstra a importância da integridade da barreira intestinal. Esta tese teve como objetivo principal o estudo exploratório da permeabilidade intestinal em doentes com lúpus eritematoso sistémico, comparando os resultados com os obtidos em controlos saudáveis. Pretendeu-se igualmente compreender se existe ou não uma associação entre permeabilidade intestinal e atividade da doença. Neste estudo realizámos uma caracterização de uma coorte de acordo com as suas características demográficas, manifestações clínicas, tratamento e estado imunológico. Foram recrutados 45 doentes com lúpus eritematoso sistémico, de acordo com os critérios ACR (American College of Rheumatology) / EULAR (The European Alliance of Associations for Rheumatology) 2019, sendo 34 doentes adultos e 11 doentes pediátricos. Foram selecionados 16 controlos saudáveis. Os critérios de exclusão para doentes e controlos incluíam historial de doenças gastrointestinais, doenças imunomediadas, doenças metabólicas e neoplasias, bem como utilização recente de antibióticos. A avaliação direta da permeabilidade intestinal baseou-se no teste da lactulose e do manitol. Este teste fundamenta-se na taxa de absorção destes dois açúcares no intestino delgado. Após o cumprimento de uma dieta restritiva no dia anterior, em jejum, os participantes ingeriram uma mistura dos dois açúcares e colheram a urina resultante durante um período de 4 horas. As amostras de urina foram processadas, alíquotadas e armazenadas a -80ºC até serem analisadas no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) por cromatografia líquida associada a espectrometria de massa. As amostras de sangue dos participantes foram colhidas, processadas, armazenadas a -80ºC e utilizadas posteriormente na avaliação indireta da permeabilidade intestinal. Recorrendo a ensaios imunoenzimáticos, determinou-se a expressão de marcadores da permeabilidade intestinal, onde se incluem a zonulina, a claudina-3, a IFABP, o sCD14 e o LPS. A zonulina é a única proteína moduladora conhecida capaz de modificar a conformação das proteínas que constituem as junções intercelulares, criando instabilidade e abertura do espaço intercelular. Justamente, a claudina-3 é uma proteína do complexo intercelular dos enterócitos que fortalece a barreira intestinal. A IFABP é uma proteína secretada pelos enterócitos aquando da ocorrência de dano intestinal. O sCD14 é a forma em circulação do CD14 que é libertada da membrana dos monócitos e macrófagos em resposta a um aumento dos níveis de LPS e que expressa um aumento de permeabilidade intestinal e ativação de células monocíticas. A ligação do sCD14 ao LPS e subsequente transporte até recetores de reconhecimento de padrões resulta no aumento de respostas inflamatórias. Por último, o LPS é um lipolissacárido que constitui a membrana externa de bactérias gram-negativas, portanto, um indicador de translocação microbiana. Adicionalmente, tentámos compreender se existia alguma correlação entre marcadores de permeabilidade e se existia uma correlação destes mesmos marcadores com a atividade da doença, avaliada com a escala SLEDAI-2K. Neste estudo, detetámos um aumento significativo do rácio lactulose/manitol em doentes com lúpus eritematoso sistémico (0.0180 vs 0.0140; p<0.05), o que implica um aumento da permeabilidade paracelular. Observou-se também que doentes diagnosticados com lúpus há 2 ou mais anos tinham um rácio lactulose/manitol superior aos doentes com uma duração de doença inferior a 2 anos (0.0200 vs 0.0145; p<0.05). Este rácio era significativamente maior em doentes com nefrite lúpica comparativamente com doentes que nunca tiveram atingimento renal (0.0190 vs 0.0135; p<0.05). Demonstrámos, assim, pela primeira vez, através de um método direto, que a permeabilidade intestinal está aumentada no lúpus eritematoso sistémico. Quanto aos marcadores indiretos de permeabilidade intestinal, detetámos que doentes com lúpus eritematoso sistémico tinham um aumento significativo dos níveis de zonulin comparativamente com controlos saudáveis (0.347 vs 0 ng/mL; p<0.01). Foi observada também uma correlação positiva entre zonulina e LPS, o que mostra a associação entre a perda de integridade da barreira intestinal e a endotoxemia. Não detetámos diferenças significativas relativamente aos níveis de claudina-3 quantificada no soro de doentes e controlos saudáveis. Os níveis de IFABP estavam aumentados no lúpus, mas apenas em doentes adultos comparativamente com os controlos saudáveis (1462 vs 878 pg/mL; p<0.05). O sCD14 estava aumentado em doentes com lúpus comparativamente com controlos saudáveis (3735 vs 2277 pg/mL; p<0.05). O aumento de sCD14 estava correlacionado com um aumento da idade e da duração da doença. Foi observada também uma correlação positiva entre o sCD14 e a IFABP. Por último, não encontrámos diferenças significativas quando comparados os níveis de LPS entre doentes com lúpus e controlos saudáveis. À exceção da claudina-3, nenhum outro marcador de permeabilidade intestinal se relacionou com a atividade da doença. Adicionalmente, doentes com uma doença ligeira tinham níveis de claudina-3 no soro significativamente inferiores aos de doentes com doença moderada a grave. Em suma, podemos concluir que os doentes com lúpus eritematoso sistémico têm maior permeabilidade intestinal, quando esta é avaliada diretamente através do teste da lactulose/manitol ou, indiretamente, através da medição da zonulina ou do sCD14. A perda da homeostasia da barreira intestinal nos doentes com lúpus eritematoso sistémico pode ser determinante no desenvolvimento da doença e na sua cronicidade. Os resultados deste trabalho abrem portas para estudos prospetivos de novas estratégias terapêuticas para aumento da integridade da barreira intestinal no lúpus eritematoso sistémico, que poderão contribuir para um melhor controlo da doença, com menos efeitos adversos.
Autores principais:	Castro, Miguel Batista Lyon de
Assunto:	Lúpus Integridade da barreira intestinal Zonulina Endotoxemia Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O lúpus eritematoso sistémico é uma doença imunomediada complexa, caracterizada por uma elevada diversidade de manifestações clínicas e por períodos de remissão e recidiva. Esta doença pode afetar a maioria dos órgãos e tecidos do corpo humano, com maior enfâse na pele, músculos e articulações, mas também nos rins e no sistema nervoso. Apesar do enorme esforço por parte da comunidade científica, a sua etiologia ainda não é totalmente compreendida. No entanto, sabe-se que fatores genéticos e ambientais contribuem para o seu desenvolvimento, despoletando uma desregulação do sistema imunitário, caracterizada pela perda de tolerância a autoantigénios, sobreativação de linfócitos e produção de autoanticorpos e de citocinas pró-inflamatórias. Esta doença afeta principalmente mulheres em idade fértil. No entanto, o lúpus na criança e no adolescente, apesar de ser mais raro do que em idade adulta, é geralmente uma doença com uma apresentação clínica mais grave, com maior atingimento renal e do sistema nervoso central. Apesar dos vários progressos em termos de diagnóstico e tratamento, o lúpus eritematoso sistémico continua a ter uma elevada taxa de morbilidade e mortalidade. Estudos recentes concluíram que a microbiota intestinal tem um papel preponderante na patogénese de várias doenças imunomediadas, incluindo o lúpus eritematoso sistémico. A microbiota intestinal é constituída por milhões de microorganismos que são essenciais para a proteção contra patogénios invasores e para a regulação da resposta imune inata e adaptativa. Em doentes com lúpus eritematoso sistémico observou-se uma alteração da diversidade da microbiota intestinal, com decréscimo no rácio Firmicutes/Bacteroidetes comparativamente com controlos saudáveis, característica que também foi observada em outras doenças autoimunes. Existe uma relação muito próxima entre a microbiota intestinal e a homeostasia da mucosa intestinal. Pensa-se que os microrganismos comensais influenciam as proteínas da barreira intestinal, alterando a sua permeabilidade, através dos seus efeitos nas junções intercelulares. Desta forma, a disbiose intestinal potencia um leaky gut que pode favorecer a passagem de microrganismos, dos seus componentes e metabolitos para a circulação sanguínea, contribuindo para a sobreativação do sistema imunitário e para a cronicidade do lúpus eritematoso sistémico. Em modelo roedor de lúpus, verificou-se que a translocação de um patogénio intestinal para o fígado e outros tecidos levava a doença e morte em animais geneticamente predispostos para a autoimunidade. Desta forma, a translocação de patogénios através de uma barreira intestinal comprometida aparenta despoletar a autoimunidade sistémica característica do lúpus, o que demonstra a importância da integridade da barreira intestinal. Esta tese teve como objetivo principal o estudo exploratório da permeabilidade intestinal em doentes com lúpus eritematoso sistémico, comparando os resultados com os obtidos em controlos saudáveis. Pretendeu-se igualmente compreender se existe ou não uma associação entre permeabilidade intestinal e atividade da doença. Neste estudo realizámos uma caracterização de uma coorte de acordo com as suas características demográficas, manifestações clínicas, tratamento e estado imunológico. Foram recrutados 45 doentes com lúpus eritematoso sistémico, de acordo com os critérios ACR (American College of Rheumatology) / EULAR (The European Alliance of Associations for Rheumatology) 2019, sendo 34 doentes adultos e 11 doentes pediátricos. Foram selecionados 16 controlos saudáveis. Os critérios de exclusão para doentes e controlos incluíam historial de doenças gastrointestinais, doenças imunomediadas, doenças metabólicas e neoplasias, bem como utilização recente de antibióticos. A avaliação direta da permeabilidade intestinal baseou-se no teste da lactulose e do manitol. Este teste fundamenta-se na taxa de absorção destes dois açúcares no intestino delgado. Após o cumprimento de uma dieta restritiva no dia anterior, em jejum, os participantes ingeriram uma mistura dos dois açúcares e colheram a urina resultante durante um período de 4 horas. As amostras de urina foram processadas, alíquotadas e armazenadas a -80ºC até serem analisadas no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) por cromatografia líquida associada a espectrometria de massa. As amostras de sangue dos participantes foram colhidas, processadas, armazenadas a -80ºC e utilizadas posteriormente na avaliação indireta da permeabilidade intestinal. Recorrendo a ensaios imunoenzimáticos, determinou-se a expressão de marcadores da permeabilidade intestinal, onde se incluem a zonulina, a claudina-3, a IFABP, o sCD14 e o LPS. A zonulina é a única proteína moduladora conhecida capaz de modificar a conformação das proteínas que constituem as junções intercelulares, criando instabilidade e abertura do espaço intercelular. Justamente, a claudina-3 é uma proteína do complexo intercelular dos enterócitos que fortalece a barreira intestinal. A IFABP é uma proteína secretada pelos enterócitos aquando da ocorrência de dano intestinal. O sCD14 é a forma em circulação do CD14 que é libertada da membrana dos monócitos e macrófagos em resposta a um aumento dos níveis de LPS e que expressa um aumento de permeabilidade intestinal e ativação de células monocíticas. A ligação do sCD14 ao LPS e subsequente transporte até recetores de reconhecimento de padrões resulta no aumento de respostas inflamatórias. Por último, o LPS é um lipolissacárido que constitui a membrana externa de bactérias gram-negativas, portanto, um indicador de translocação microbiana. Adicionalmente, tentámos compreender se existia alguma correlação entre marcadores de permeabilidade e se existia uma correlação destes mesmos marcadores com a atividade da doença, avaliada com a escala SLEDAI-2K. Neste estudo, detetámos um aumento significativo do rácio lactulose/manitol em doentes com lúpus eritematoso sistémico (0.0180 vs 0.0140; p<0.05), o que implica um aumento da permeabilidade paracelular. Observou-se também que doentes diagnosticados com lúpus há 2 ou mais anos tinham um rácio lactulose/manitol superior aos doentes com uma duração de doença inferior a 2 anos (0.0200 vs 0.0145; p<0.05). Este rácio era significativamente maior em doentes com nefrite lúpica comparativamente com doentes que nunca tiveram atingimento renal (0.0190 vs 0.0135; p<0.05). Demonstrámos, assim, pela primeira vez, através de um método direto, que a permeabilidade intestinal está aumentada no lúpus eritematoso sistémico. Quanto aos marcadores indiretos de permeabilidade intestinal, detetámos que doentes com lúpus eritematoso sistémico tinham um aumento significativo dos níveis de zonulin comparativamente com controlos saudáveis (0.347 vs 0 ng/mL; p<0.01). Foi observada também uma correlação positiva entre zonulina e LPS, o que mostra a associação entre a perda de integridade da barreira intestinal e a endotoxemia. Não detetámos diferenças significativas relativamente aos níveis de claudina-3 quantificada no soro de doentes e controlos saudáveis. Os níveis de IFABP estavam aumentados no lúpus, mas apenas em doentes adultos comparativamente com os controlos saudáveis (1462 vs 878 pg/mL; p<0.05). O sCD14 estava aumentado em doentes com lúpus comparativamente com controlos saudáveis (3735 vs 2277 pg/mL; p<0.05). O aumento de sCD14 estava correlacionado com um aumento da idade e da duração da doença. Foi observada também uma correlação positiva entre o sCD14 e a IFABP. Por último, não encontrámos diferenças significativas quando comparados os níveis de LPS entre doentes com lúpus e controlos saudáveis. À exceção da claudina-3, nenhum outro marcador de permeabilidade intestinal se relacionou com a atividade da doença. Adicionalmente, doentes com uma doença ligeira tinham níveis de claudina-3 no soro significativamente inferiores aos de doentes com doença moderada a grave. Em suma, podemos concluir que os doentes com lúpus eritematoso sistémico têm maior permeabilidade intestinal, quando esta é avaliada diretamente através do teste da lactulose/manitol ou, indiretamente, através da medição da zonulina ou do sCD14. A perda da homeostasia da barreira intestinal nos doentes com lúpus eritematoso sistémico pode ser determinante no desenvolvimento da doença e na sua cronicidade. Os resultados deste trabalho abrem portas para estudos prospetivos de novas estratégias terapêuticas para aumento da integridade da barreira intestinal no lúpus eritematoso sistémico, que poderão contribuir para um melhor controlo da doença, com menos efeitos adversos.