Publicação

Cytotoxic effects of the food bioactive compound thymoquinone in human renal cancer cells

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O cancro renal está entre os 10 tipos de cancro mais comuns no mundo, com um número estimado de 350.000 pessoas diagnosticadas cada ano (dados de 2013), sendo que nos países mais desenvolvidos o número de casos reportados é mais elevado. Este tipo de cancro, que afeta mais os homens que as mulheres, tem sido responsável por aproximadamente 140000 mortes por ano na Europa. O subtipo de cancro renal mais prevalente é o carcinoma renal de células claras (ccRCC), representando cerca de 70-80% dos casos diagnosticados, com uma taxa de mortalidade de cerca de 20-40%. Em Portugal, a taxa de incidência em homens e mulheres foi de 10,4 e 4,0 por 100.000 indivíduos, respetivamente (dados de 2012), correspondendo a valores inferiores aos da média europeia. Por seu lado, no caso dos Estados Unidos da América, o cancro renal é o sexto cancro mais comum nos homens e o décimo nas mulheres. Dados recentes apontam para um aumento a nível global da incidência e mortalidade de cancro renal. Têm sido descritos vários fatores de risco para esta patologia oncológica. Neste sentido, a obesidade, o fumo do tabaco e a hipertensão têm sido associados ao cancro renal e apontados como fatores que podem elevar o risco de desenvolver a doença. Não obstante, há ainda que destacar que 2-3% dos casos são de natureza hereditária, resultantes de mutações genéticas caracterizadas. No que respeita ao tratamento desta doença, a opção terapêutica mais utilizada atualmente é a chamada terapêutica direcionada (“targeted therapy”), através da utilização de fármacos que atuam em alvos biológicos selecionados. É importante referir que, na maioria dos casos, a quimioterapia clássica e a radioterapia convencional não são eficazes no tratamento do ccRCC. Neste sentido, torna-se efetivamente importante explorar outras alternativas terapêuticas para este cancro, sendo que a investigação dos possíveis efeitos antitumorais de compostos bioativos de origem natural é considerada uma opção pertinente. A timoquinona (TQ) é um composto natural encontrado nas sementes da Nigella Sativa conhecidas por cominho preto (“black cumin”/ “Black seed”). Do posto de vista nutricional, as percentagens de vitaminas, proteínas, minerais e glúcidos variam de acordo com a distribuição geográfica, o tempo de colheita e o método de cultivo da planta. As sementes têm sido usadas como especiaria na culinária, bem como na medicina popular desde há muitos anos. De facto, desde a antiguidade que estas sementes contendo a TQ têm sido utilizadas no tratamento de uma variedade de patologias variadas, que vão desde a diabetes mellitus até doenças do trato gastrointestinal. Esta semente é mais utilizada em países do Medio Oriente e na Asia, tendo-se constatado nessas regiões uma incidência menor da referida patologia oncológica. Tal como foi acima referido, a TQ é a substância que se encontra em maior quantidade na semente do cominho negro, tendo sido isolada pela primeira vez em 1963. As suas potenciais propriedades farmacológicas são, de facto, notáveis, tendo a TQ sido apontada como protetora a nível gástrico, hepático, neurológico, renal e cardíaco, para além de terem sido referenciadas propriedades analgésicas e anti-inflamatórias. No entanto, a TQ também apresenta toxicidade, sendo descritos efeitos nocivos, nomeadamente efeitos citotóxicos, genotóxicos, teratogénicos, bem como toxicidade a nível do desenvolvimento embrionário. Contudo, existem também várias evidências dos efeitos benéficos por parte da TQ num contexto oncológico, sendo eficaz em diferentes modelos de cancro, como por exemplo em cancro de mama, leucemia, cancro de cólon, entre outros. No seu conjunto, estes estudos têm sugerido que a TQ funciona como um composto anti-proliferativo, anti-angiogénico, anti-metastático e pro-apoptótico, características relevantes que suportam estudos adicionais noutros modelos de cancro, como por exemplo no cancro renal. A TQ também tem sido apontada como um composto adjuvante na terapia do cancro, uma vez que pode funcionar como citoprotector. Tem sido sugerido que a TQ protege as células de danos oxidativos resultantes dos fármacos usados em quimioterapia. Este composto bioativo tem também um potencial efeito sinérgico na desaceleração do processo de carcinogénese após exposição conjunta com agentes terapêuticos convencionais. Ainda assim, existem diversas lacunas na sua eficácia, sobretudo no seu papel ativo nos mecanismos através dos quais a TQ atua nas células cancerosas. Por outro lado, no caso do ccRCC o número de estudos com TQ disponíveis é ainda escasso. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar e caracterizar os efeitos citotóxicos induzidos pela TQ usando abordagens complementares in vitro, tendo como modelo de estudo as células renais 786-O, uma linha celular humana representativa de ccRCC. No trabalho experimental efetuado as células de ccRCC foram expostas a uma gama de concentrações de TQ (1-100 μM), durante dois períodos de tempo, de 24 e 48 horas. A utilização de diferentes tempos de incubação e níveis de concentração é importante para se obter o máximo de informação em estudos in vitro. Também a utilização de dois ensaios de viabilidade celular baseados em fundamentos metodológicos diferentes é relevante pois como é sabido cada técnica para avaliar a viabilidade celular tem as suas vantagens e inconvenientes. Em primeiro lugar, foi realizado o ensaio do Cristal Violeta (CV), um método colorimétrico que se baseia na coloração de células aderentes viáveis, uma vez que este corante tem a capacidade de se ligar ao ADN. Os resultados mostraram claramente que a TQ induziu a um decréscimo da viabilidade celular dependente da concentração e do tempo de exposição. Com este ensaio, os valores de IC50 obtidos foram 10,8 μM e 3,8 μM para as 24 e 48 h de exposição, respetivamente. De seguida, procedeu-se ao ensaio de redução do MTS. Esta técnica baseia-se na redução enzimática do composto tetrazólio MTS na mitocôndria das células viáveis. Com esta técnica a TQ também revelou ser citotóxica para as células 786-O, sendo os valores de IC50 um pouco mais elevados (12,9 μM e 8,4 μM para as 24 e 48 h). Procurou-se neste trabalho também avaliar o papel do tratamento com glutationa reduzida (GSH) na citotoxicidade da TQ (20-100 μM). Os resultados obtidos mostram claramente um papel relevante da co-incubação com GSH (1,0 mM), mostrando um aumento marcado da viabilidade celular das células 786-O com significado estatístico. Este aumento poderá ser uma consequência da conjugação extracelular da TQ ou, em alternativa, o resultado do poder antioxidante da GSH, algo amplamente descrito na literatura. O impacto da TQ na distribuição do ciclo celular foi avaliado seguidamente usando citometria de fluxo. Os resultados obtidos apontam para um aumento da percentagem das células em fase sub-G1, o qual foi mais evidente para o tempo de incubação de 48 horas e para concentrações de TQ > 20 μM. Os resultados foram confirmados pelo ensaio Anexina V/PI, tendo-se verificado um aumento da percentagem de células apoptóticas dependente da concentração de TQ. A indução de apoptose pela TQ poderá ser uma consequência de processos de regulação de proteínas pró-apoptóticas/anti-apoptóticas. No entanto, a indução de espécies reativas de oxigénio pela TQ deverá ser também considerada neste contexto. Em resumo, os resultados obtidos no âmbito deste estudo mostram claramente que a TQ tem um potencial citotóxico importante em células de ccRCC, mostrando propriedades antitumorais que suportam uma investigação mais aprofundada com vista a uma possível utilização na terapêutica do cancro renal. No entanto, estudos adicionais são necessários para se compreender melhor os mecanismos apoptóticos subjacentes, bem como as consequências da combinação da TQ com os fármacos de primeira linha usados nos dias de hoje para o cancro renal.
Autores principais:	Jackson, Constance Victoria Garrido
Assunto:	Thymoquinone Black cumin Nigella Sativa Renal cancer Cytotoxicity 786-O Renal cancer cell Teses de mestrado -2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa