Publicação

LET-and radiation quality-dependence of the complexity of DNA damages

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Esta tese aborda o estudo dos efeitos biol´ogicos induzidos por exposição à radiação-alfa (_) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e por exposição às radiações alfa e gama () em células saudáveis (não cancerígenas) da próstata humana (RWPE-1). A radiação ionizante pode interagir de duas formas com o DNA (o principal alvo da radiação ionizante): diretamente, ao quebrar as ligações dos pares de bases da cadeia de DNA, ou indiretamente, ao quebrar as ligações de moléculas de água envolventes dando origem a radicais livres que podem interagir com a molécula de DNA. Existem vários tipos de danos, entre eles danos de base (base damage) ou singlestrand breaks, mas os mais graves são os double-strand breaks (DSBs), isto é, quando a radiação é capaz de quebrar as ligações de dois pares de bases (pb, ou, em inglês, bp, base pairs), no mínimo, que distam a 10 bp ou menos e em cadeias opostas. Estas quebras podem resultar na clivagem da molécula de DNA e a célula pode não conseguir repará-las, dando a origem a mutações ou outros efeitos biológicos graves. Quando existe um DSB numa molécula de DNA, começa a existir um aglomerado de proteínas reparadoras nessa zona, proteínas essas que podem ser marcadas com marcadores florescentes e, posteriormente, serem observadas com a técnica de microscopia de florescência como focos (pequenos objetos circulares fluorescentes). Numa altura em que a radioterapia está a ganhar cada vez mais interesse e terreno nas opções de tratamento contra o cancro, é importante perceber como diferentes radiações causam danos nas moléculas de DNA. Numa primeira parte, fez-se um estudo estatístico de dados recolhidos numa experiencia levada a cabo em 2014, no PTB, realizado pelos orientadores. Nesta experiencia células HUVEC foram expostas a radiaço alfa de várias energias (8, 10 e 20 MeV) e a protões de 3 MeV. O PTB possui um sistema de microfeixe capaz de controlar o número de partículas emitido e o local onde são emitidas, dado a possibilidade de atingir diretamente o núcleo das células, em contrapartida aos broadbeam, que irradiam toda a área exposta. Desta maneira podemos controlar o número de focos que esperamos observar em fluorescência. Após uma etapa de reconhecimento das células, cada núcleo reconhecido foi exposto a 5 partículas do tipo de radiação em causa, no padrão quincunce (semelhante ao lado 5 de um dado). Após a radiação, seguiu-se o protocolo do ensaio de focos (Foci Assay). O objetivo deste estudo passou por tentar obter, para cada qualidade de radiação, uma estimativa para a probabilidade de uma partícula dessa radiação induzir um dano na cadeia de DNA. Para tal, as células expostas foram fotografadas com recurso a uma câmara acoplada a um microscópio de fluorescência e as imagens foram analisadas pelo software CellProfiler para identificação dos núcleos e do número de focos em cada um deles, bem como outras características de cada objeto, como intensidade e área. Os dados foram simulados como uma convolução entre uma função I(k) que representa os focos induzidos por radiação e uma função B(k), que representa os focos de background (devidos a manuseamento, stress, entre outras razões biológicas). Numa primeira abordagem verificou-se que B(k) seguia uma distribuição de decaimento exponencial, no entanto os processos básicos de limpeza de dados resultavam num ajuste fraco. Assim sendo, e como conhecer a função B(k) ou estimá-la corretamente é importante, o foco desta parte passou a ser encontrar a melhor função de ajuste B(k) aos dados aplicando valores limiares a parâmetros intrínsecos aos objetos como a intensidade total dos focos e a área dos núcleos. No que diz respeito à intensidade dos focos, aplicou-se valores limites entre 0 e 100. Em cada situação, focos com intensidade inferior ao limite eram descartados dos dados e procedeu-se ao ajuste de uma função de decaimento exponencial com parâmetros a (amplitude) e b (argumento da exponencial). Os ajustes foram comparados usando o teste do chi-quadrado Goodness of Fit. Neste teste os valores reais e obtidos pela função são comparados e o ajuste que apresenta o menor valor de chi-quadrado representa o melhor ajuste aos dados. Para a intensidade dos focos, verificou-se que o limite de 23 era o parâmetro ótimo (X2 = 0.070), registando uma melhoria em relação à situação em que nenhum limite é aplicado (X2 = 0.124). No passo seguinte, focámo-nos na área dos núcleos. Após observar a distribuição desta variável, escolheu-se três limites inferiores (4000, 7000 e 9000 pxl2) e três superiores (16000, 18000 e 21000 pxl2) e testou-se todas as combinações. O par de limites 7000/21000 (X2 = 0.0044) foi o que apresentou a maior melhoria no ajuste. Apesar da melhoria significativa na função B(k) e também numa notável melhoria na função de ajuste I(k), uma sobreposição linear de três binomiais de parâmetro p (probabilidade de induzir um dano), verificou-se que os parâmetros ótimos para os dados de background não são os mesmos para os dados de células irradiadas, pelo que o processo de limpeza destes últimos necessita de ser revisto no futuro. A segunda parte do trabalho tinha como objetivo avaliar o Relative Biological Effectiveness (RBE) de protões na linha celular RWPE-1, células saudáveis epiteliais da próstata humana, através do Ensaio Clonogénico. O cancro da próstata é tratado mundialmente com recurso à radioterapia, sendo os protões a radiação escolhida, pelo que é importante averiguar qual a resposta das células saudáveis, que são circundantes às células cancerígenas, a esta radiação. Devido a problemas experimentais e questões de calendário, não foi possível realizar a experiência usando um feixe de protões, pelo que se optou por fazer um estudo usando a fonte radioativa Amerício-241, emissora de partículas alfa. Um grupo de células foi exposto a 0.5, 1, 2, 4, 6 e 10 Gy de fotões de Cobalto-60 e um segundo grupo foi exposto a 0.25, 0.5, 1 e 2 Gy de partículas alfa de Am-241. Para os fotões, sendo uma radiação pouco ionizante, usou-se o Modelo Linear Quadrático para se obter um ajuste aos dados, com resultados αϒ = 0:47 +- 0:01 Gy-1 e ϐϒ = 0:006 +- 0:001 Gy-2. Para as partículas alfa, usou-se o Modelo Linear, obtendo-se o parâmetro α = 1:13 +- 0:02 Gy-2. O valor de RBE obtido, para uma fração de sobrevivência de 10%, para a radiação alfa emitida pela fonte de Amerício-241 foi de 2:27 +- 0:06. Este valor encontra-se longe de outros valores reportados por outras equipas, embora a comparação com estes não seja 100% correta, uma vez que o RBE depende não só da radiação escolhida, como da radiação de referência (no nosso caso foi fotões de Co-60, nos outros usou-se Raios-X ou Cs-137) e, ainda mais importante, a linha celular usada. Sentiram-se ainda alguns problemas experimentais que poderão ter afetado o resultado final, uma vez que não foi possível recolher dados suficientes para inferir valores estatisticamente válidos. Em conclusão, os objetivos iniciais desta tese não foram alcançados, mas o trabalho realizado abre portas para uma futura discussão de como analisar dados provenientes de um ensaio de focos, acentuando a importância de corretamente separar os dados obtidos, tentando ao máximo selecionar apenas os dados que são realmente relevantes para a análise. Relativamente ao segundo estudo, mantém-se ainda de grande interesse avaliar a resposta de células saudáveis da próstata aos protões, não só porque é importante registar a possível letalidade, como a falta de dados para esta linha celular pode tornar o tratamento perigoso.
Autores principais:	Canhoto, João de Figueiredo
Assunto:	Focos induzidos por radiação Ensaio clonogénico Radioterapia Dosimetria Estatística Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Esta tese aborda o estudo dos efeitos biol´ogicos induzidos por exposição à radiação-alfa (_) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e por exposição às radiações alfa e gama () em células saudáveis (não cancerígenas) da próstata humana (RWPE-1). A radiação ionizante pode interagir de duas formas com o DNA (o principal alvo da radiação ionizante): diretamente, ao quebrar as ligações dos pares de bases da cadeia de DNA, ou indiretamente, ao quebrar as ligações de moléculas de água envolventes dando origem a radicais livres que podem interagir com a molécula de DNA. Existem vários tipos de danos, entre eles danos de base (base damage) ou singlestrand breaks, mas os mais graves são os double-strand breaks (DSBs), isto é, quando a radiação é capaz de quebrar as ligações de dois pares de bases (pb, ou, em inglês, bp, base pairs), no mínimo, que distam a 10 bp ou menos e em cadeias opostas. Estas quebras podem resultar na clivagem da molécula de DNA e a célula pode não conseguir repará-las, dando a origem a mutações ou outros efeitos biológicos graves. Quando existe um DSB numa molécula de DNA, começa a existir um aglomerado de proteínas reparadoras nessa zona, proteínas essas que podem ser marcadas com marcadores florescentes e, posteriormente, serem observadas com a técnica de microscopia de florescência como focos (pequenos objetos circulares fluorescentes). Numa altura em que a radioterapia está a ganhar cada vez mais interesse e terreno nas opções de tratamento contra o cancro, é importante perceber como diferentes radiações causam danos nas moléculas de DNA. Numa primeira parte, fez-se um estudo estatístico de dados recolhidos numa experiencia levada a cabo em 2014, no PTB, realizado pelos orientadores. Nesta experiencia células HUVEC foram expostas a radiaço alfa de várias energias (8, 10 e 20 MeV) e a protões de 3 MeV. O PTB possui um sistema de microfeixe capaz de controlar o número de partículas emitido e o local onde são emitidas, dado a possibilidade de atingir diretamente o núcleo das células, em contrapartida aos broadbeam, que irradiam toda a área exposta. Desta maneira podemos controlar o número de focos que esperamos observar em fluorescência. Após uma etapa de reconhecimento das células, cada núcleo reconhecido foi exposto a 5 partículas do tipo de radiação em causa, no padrão quincunce (semelhante ao lado 5 de um dado). Após a radiação, seguiu-se o protocolo do ensaio de focos (Foci Assay). O objetivo deste estudo passou por tentar obter, para cada qualidade de radiação, uma estimativa para a probabilidade de uma partícula dessa radiação induzir um dano na cadeia de DNA. Para tal, as células expostas foram fotografadas com recurso a uma câmara acoplada a um microscópio de fluorescência e as imagens foram analisadas pelo software CellProfiler para identificação dos núcleos e do número de focos em cada um deles, bem como outras características de cada objeto, como intensidade e área. Os dados foram simulados como uma convolução entre uma função I(k) que representa os focos induzidos por radiação e uma função B(k), que representa os focos de background (devidos a manuseamento, stress, entre outras razões biológicas). Numa primeira abordagem verificou-se que B(k) seguia uma distribuição de decaimento exponencial, no entanto os processos básicos de limpeza de dados resultavam num ajuste fraco. Assim sendo, e como conhecer a função B(k) ou estimá-la corretamente é importante, o foco desta parte passou a ser encontrar a melhor função de ajuste B(k) aos dados aplicando valores limiares a parâmetros intrínsecos aos objetos como a intensidade total dos focos e a área dos núcleos. No que diz respeito à intensidade dos focos, aplicou-se valores limites entre 0 e 100. Em cada situação, focos com intensidade inferior ao limite eram descartados dos dados e procedeu-se ao ajuste de uma função de decaimento exponencial com parâmetros a (amplitude) e b (argumento da exponencial). Os ajustes foram comparados usando o teste do chi-quadrado Goodness of Fit. Neste teste os valores reais e obtidos pela função são comparados e o ajuste que apresenta o menor valor de chi-quadrado representa o melhor ajuste aos dados. Para a intensidade dos focos, verificou-se que o limite de 23 era o parâmetro ótimo (X2 = 0.070), registando uma melhoria em relação à situação em que nenhum limite é aplicado (X2 = 0.124). No passo seguinte, focámo-nos na área dos núcleos. Após observar a distribuição desta variável, escolheu-se três limites inferiores (4000, 7000 e 9000 pxl2) e três superiores (16000, 18000 e 21000 pxl2) e testou-se todas as combinações. O par de limites 7000/21000 (X2 = 0.0044) foi o que apresentou a maior melhoria no ajuste. Apesar da melhoria significativa na função B(k) e também numa notável melhoria na função de ajuste I(k), uma sobreposição linear de três binomiais de parâmetro p (probabilidade de induzir um dano), verificou-se que os parâmetros ótimos para os dados de background não são os mesmos para os dados de células irradiadas, pelo que o processo de limpeza destes últimos necessita de ser revisto no futuro. A segunda parte do trabalho tinha como objetivo avaliar o Relative Biological Effectiveness (RBE) de protões na linha celular RWPE-1, células saudáveis epiteliais da próstata humana, através do Ensaio Clonogénico. O cancro da próstata é tratado mundialmente com recurso à radioterapia, sendo os protões a radiação escolhida, pelo que é importante averiguar qual a resposta das células saudáveis, que são circundantes às células cancerígenas, a esta radiação. Devido a problemas experimentais e questões de calendário, não foi possível realizar a experiência usando um feixe de protões, pelo que se optou por fazer um estudo usando a fonte radioativa Amerício-241, emissora de partículas alfa. Um grupo de células foi exposto a 0.5, 1, 2, 4, 6 e 10 Gy de fotões de Cobalto-60 e um segundo grupo foi exposto a 0.25, 0.5, 1 e 2 Gy de partículas alfa de Am-241. Para os fotões, sendo uma radiação pouco ionizante, usou-se o Modelo Linear Quadrático para se obter um ajuste aos dados, com resultados αϒ = 0:47 +- 0:01 Gy-1 e ϐϒ = 0:006 +- 0:001 Gy-2. Para as partículas alfa, usou-se o Modelo Linear, obtendo-se o parâmetro α = 1:13 +- 0:02 Gy-2. O valor de RBE obtido, para uma fração de sobrevivência de 10%, para a radiação alfa emitida pela fonte de Amerício-241 foi de 2:27 +- 0:06. Este valor encontra-se longe de outros valores reportados por outras equipas, embora a comparação com estes não seja 100% correta, uma vez que o RBE depende não só da radiação escolhida, como da radiação de referência (no nosso caso foi fotões de Co-60, nos outros usou-se Raios-X ou Cs-137) e, ainda mais importante, a linha celular usada. Sentiram-se ainda alguns problemas experimentais que poderão ter afetado o resultado final, uma vez que não foi possível recolher dados suficientes para inferir valores estatisticamente válidos. Em conclusão, os objetivos iniciais desta tese não foram alcançados, mas o trabalho realizado abre portas para uma futura discussão de como analisar dados provenientes de um ensaio de focos, acentuando a importância de corretamente separar os dados obtidos, tentando ao máximo selecionar apenas os dados que são realmente relevantes para a análise. Relativamente ao segundo estudo, mantém-se ainda de grande interesse avaliar a resposta de células saudáveis da próstata aos protões, não só porque é importante registar a possível letalidade, como a falta de dados para esta linha celular pode tornar o tratamento perigoso.