Publicação

Studies on the role and regulation of the multidrug resistance efflux pumps Tp01 and Pdr18 in yeast tolerance to ethanol and weak acid stresses, to increase yeast robustness

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A resistência a múltiplas drogas é a resistência simultânea de um organismo a uma vasta gama de compostos químicos tóxicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados. A compreensão deste fenómeno é de extrema importância, pois provoca problemas graves em diversas áreas, como por exemplo na preservação dos alimentos, no tratamento do cancro e de doenças infecciosas e na proteção química das colheitas. Por outro lado, este fenómeno pode também ter consequências positivas, como seja a capacidade de microrganismos industriais tolerarem o stress induzido por produtos do metabolismo cuja produção é desejada (por exemplo a produção de etanol durante a fermentação alcoólica de bebidas fermentadas ou produção de bioetanol). Existem vários mecanismos associados à aquisição de resistência a múltiplas drogas, entre eles a ação de bombas de efluxo presentes na membrana plasmática das células, sendo este um mecanismo altamente conservado. Em levedura, existem duas superfamílias de transportadores que conferem resistência a múltiplas drogas: a superfamília de transportadores “Major Facilitator” (MFS) e a superfamília de transportadores “ATP-binding cassette” (ABC). Pdr18 é um transportador da superfamília ABC responsável pela resistência da levedura a múltiplos compostos como os herbicidas ácido diclorofenóxiacético (2,4-D) e barban, o fungicída agrícola mancozeb e cádmio, cobre, manganésio, zinco, os agentes antineoplásicos cisplatina e carboplatina e o antifúngico nocodazole. Recentemente, no nosso laboratório, foi atribuído ao Pdr18 um papel na incorporação de ergosterol na membrana plasmática das células de levedura e este transportador foi o único, de entre um grupo de 21 transportadores das superfamílias MFS e ABC, que se verificou conferir resistência a concentrações inibitórias de etanol. Neste estudo foi confirmado e clarificado o papel deste transportador ABC na resistência a etanol. Os resultados deste trabalho mostram que o Pdr18 é responsável pela diminuição do nível de permeabilização das células de levedura induzida pelo etanol. Foi construída e caracterizada uma estirpe que sobre-expressa, no genoma, o gene PDR18 (BY4741_+PDR18), na qual o seu promotor natural foi substituído pelo promotor do gene PDR5 do mesmo organismo originando uma expressão basal do gene PDR18 superior à que este tem na estirpe selvagem. Esta estirpe modificada é mais tolerante a concentrações elevadas de etanol, permitindo o crescimento celular para concentrações de etanol perto das letais para a estirpe selvagem e diminuindo a permeabilidade celular de células sujeitas a etanol, apresentando as células geneticamente modificadas uma menor permeabilidade face à estirpe original, mesmo em condições controlo. O uso da estirpe mais robusta levou à produção de concentrações mais elevadas de etanol atingidas durante a fermentação alcoólica e este melhor desempenho da atividade fermentativa foi relacionado com a menor permeabilização celular da estirpe BY4741_+PDR18 induzida por etanol. A estratégia adoptada neste estudo apresenta-se como uma boa opção para a manipulação da expressão deste gene em estirpes industriais, dado que o promotor do gene PDR5 leva a um aumento da expressão do gene PDR18 durante a fermentação alcoólica quando comparado com o promotor natural do gene. Outra vantagem desta estratégia prende-se com a possibilidade de utilizar esta nova estirpe em meio muito rico, semelhante ao utilizado industrialmente para fermentação, dado ter-se efectuado uma manipulação ao nível do genoma, que dispensa os inconvenientes práticos e económicos de manter a pressão seletiva durante um processo fermentativo industrial, situação que seria necessária caso a estratégia envolvesse a inserção de um plasmídeo na levedura utilizada no processo. O Tpo1 é um transportador da superfamília MFS extensivamente estudado, que confere resistência a uma vasta gama de compostos, tais como os antimaláricos quinidina e artesunato, o imunosupressor ácido micofenólico, 2,4-D, o antibiótico bleomicina, noconazol, mancozeb, o anti-inflamatório diclofenaco e os ácidos orgânicos de cadeia pequena e média ácido acético, ácido decanóico e ácido octanóico. O Tpo1 está descrito como um transportador de poliaminas (espermina e espermidina) para o exterior da célula. Neste trabalho examinou-se a função do transportador Tpo1 na resistência ao stress induzido nas células de levedura pelo ácido benzóico, um ácido fraco muito utilizado como conservante na indústria alimentar, em alimentos acidulados. Resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram o envolvimento do Tpo1 na resistência da levedura ao ácido benzóico. Sabe-se ainda que este transportador de membrana não está envolvido na diminuição da acumulação do ácido benzóico no interior da célula, propondo-se que, tal como foi já observado em outros transportadores MFS, o papel fisiológico do transportador de membrana Tpo1, não completamente clarificado, resulta de forma furtuita numa maior resistência ao ácido benzóico. Neste trabalho foi também estudada a regulação transcricional do gene TPO1 perante condições de stress induzido por ácido benzóico. Demonstra-se que o Tpo1 está envolvido na homeostasia de aminoácidos e, consistentemente, confirmou-se que a ativação da expressão do gene TPO1, em condições de stress causado por ácido benzóico, está dependente dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1, dois reguladores da homeostasia de aminoácidos. Neste trabalho, foi construído um plasmídeo de fusão transcricional, em que o gene lacZ se encontra sob a regulação do promotor do gene TPO1. Recorrendo a reações de mutagénese dirigida, foram mutados individualmente os locais de ligação dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1. Células de levedura transformadas com os diferentes plasmídeos foram sujeitas a crescimento em presença ou ausência de ácido benzoico e a ativação do promotor foi avaliada. Verificou-se que uma mutação que anule qualquer dos locais de ligação do Gcn4 ou do Stp1 diminui drasticamente a ativação da expressão. Juntamente com resultados do nosso grupo não publicados, pôde-se concluir que a ativação da expressão do gene TPO1 em condições de stress induzido por ácido benzóico depende da ligação direta e simultânea destes dois factores de transcrição no promotor.
Autores principais:	Godinho, Cláudia Sofia Pires, 1990-
Assunto:	Etanol Resistência microbiana a drogas Saccharomyces cerevisiae Teses de mestrado - 2012
Ano:	2012
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A resistência a múltiplas drogas é a resistência simultânea de um organismo a uma vasta gama de compostos químicos tóxicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados. A compreensão deste fenómeno é de extrema importância, pois provoca problemas graves em diversas áreas, como por exemplo na preservação dos alimentos, no tratamento do cancro e de doenças infecciosas e na proteção química das colheitas. Por outro lado, este fenómeno pode também ter consequências positivas, como seja a capacidade de microrganismos industriais tolerarem o stress induzido por produtos do metabolismo cuja produção é desejada (por exemplo a produção de etanol durante a fermentação alcoólica de bebidas fermentadas ou produção de bioetanol). Existem vários mecanismos associados à aquisição de resistência a múltiplas drogas, entre eles a ação de bombas de efluxo presentes na membrana plasmática das células, sendo este um mecanismo altamente conservado. Em levedura, existem duas superfamílias de transportadores que conferem resistência a múltiplas drogas: a superfamília de transportadores “Major Facilitator” (MFS) e a superfamília de transportadores “ATP-binding cassette” (ABC). Pdr18 é um transportador da superfamília ABC responsável pela resistência da levedura a múltiplos compostos como os herbicidas ácido diclorofenóxiacético (2,4-D) e barban, o fungicída agrícola mancozeb e cádmio, cobre, manganésio, zinco, os agentes antineoplásicos cisplatina e carboplatina e o antifúngico nocodazole. Recentemente, no nosso laboratório, foi atribuído ao Pdr18 um papel na incorporação de ergosterol na membrana plasmática das células de levedura e este transportador foi o único, de entre um grupo de 21 transportadores das superfamílias MFS e ABC, que se verificou conferir resistência a concentrações inibitórias de etanol. Neste estudo foi confirmado e clarificado o papel deste transportador ABC na resistência a etanol. Os resultados deste trabalho mostram que o Pdr18 é responsável pela diminuição do nível de permeabilização das células de levedura induzida pelo etanol. Foi construída e caracterizada uma estirpe que sobre-expressa, no genoma, o gene PDR18 (BY4741_+PDR18), na qual o seu promotor natural foi substituído pelo promotor do gene PDR5 do mesmo organismo originando uma expressão basal do gene PDR18 superior à que este tem na estirpe selvagem. Esta estirpe modificada é mais tolerante a concentrações elevadas de etanol, permitindo o crescimento celular para concentrações de etanol perto das letais para a estirpe selvagem e diminuindo a permeabilidade celular de células sujeitas a etanol, apresentando as células geneticamente modificadas uma menor permeabilidade face à estirpe original, mesmo em condições controlo. O uso da estirpe mais robusta levou à produção de concentrações mais elevadas de etanol atingidas durante a fermentação alcoólica e este melhor desempenho da atividade fermentativa foi relacionado com a menor permeabilização celular da estirpe BY4741_+PDR18 induzida por etanol. A estratégia adoptada neste estudo apresenta-se como uma boa opção para a manipulação da expressão deste gene em estirpes industriais, dado que o promotor do gene PDR5 leva a um aumento da expressão do gene PDR18 durante a fermentação alcoólica quando comparado com o promotor natural do gene. Outra vantagem desta estratégia prende-se com a possibilidade de utilizar esta nova estirpe em meio muito rico, semelhante ao utilizado industrialmente para fermentação, dado ter-se efectuado uma manipulação ao nível do genoma, que dispensa os inconvenientes práticos e económicos de manter a pressão seletiva durante um processo fermentativo industrial, situação que seria necessária caso a estratégia envolvesse a inserção de um plasmídeo na levedura utilizada no processo. O Tpo1 é um transportador da superfamília MFS extensivamente estudado, que confere resistência a uma vasta gama de compostos, tais como os antimaláricos quinidina e artesunato, o imunosupressor ácido micofenólico, 2,4-D, o antibiótico bleomicina, noconazol, mancozeb, o anti-inflamatório diclofenaco e os ácidos orgânicos de cadeia pequena e média ácido acético, ácido decanóico e ácido octanóico. O Tpo1 está descrito como um transportador de poliaminas (espermina e espermidina) para o exterior da célula. Neste trabalho examinou-se a função do transportador Tpo1 na resistência ao stress induzido nas células de levedura pelo ácido benzóico, um ácido fraco muito utilizado como conservante na indústria alimentar, em alimentos acidulados. Resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram o envolvimento do Tpo1 na resistência da levedura ao ácido benzóico. Sabe-se ainda que este transportador de membrana não está envolvido na diminuição da acumulação do ácido benzóico no interior da célula, propondo-se que, tal como foi já observado em outros transportadores MFS, o papel fisiológico do transportador de membrana Tpo1, não completamente clarificado, resulta de forma furtuita numa maior resistência ao ácido benzóico. Neste trabalho foi também estudada a regulação transcricional do gene TPO1 perante condições de stress induzido por ácido benzóico. Demonstra-se que o Tpo1 está envolvido na homeostasia de aminoácidos e, consistentemente, confirmou-se que a ativação da expressão do gene TPO1, em condições de stress causado por ácido benzóico, está dependente dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1, dois reguladores da homeostasia de aminoácidos. Neste trabalho, foi construído um plasmídeo de fusão transcricional, em que o gene lacZ se encontra sob a regulação do promotor do gene TPO1. Recorrendo a reações de mutagénese dirigida, foram mutados individualmente os locais de ligação dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1. Células de levedura transformadas com os diferentes plasmídeos foram sujeitas a crescimento em presença ou ausência de ácido benzoico e a ativação do promotor foi avaliada. Verificou-se que uma mutação que anule qualquer dos locais de ligação do Gcn4 ou do Stp1 diminui drasticamente a ativação da expressão. Juntamente com resultados do nosso grupo não publicados, pôde-se concluir que a ativação da expressão do gene TPO1 em condições de stress induzido por ácido benzóico depende da ligação direta e simultânea destes dois factores de transcrição no promotor.