Publicação
Implementation and characterization of a three-dimensional model of blood-brain barrier vasculature
| Resumo: | A barreira hematoencefálica (BHE) é a interface que separa o tecido neuronal do sangue em circulação, tendo como principal componente as células endoteliais da microvasculatura encefálica. Esta barreira é composta pela membrana basal e por astrócitos, pericitos, microglia e neurónios, cujo conjunto é designado por unidade neurovascular. A BHE tem como principais funções: (1) assegurar a correta nutrição do encéfalo, (2) prevenir a entrada de substâncias ou moléculas que possam causar dano ao tecido neuronal e (3) controlar a passagem de iões entre a corrente sanguínea e o parênquima encefálico. Os estudos mais recentes relacionados com a BHE têm gerado resultados muito promissores. No entanto, a maioria utiliza modelos de duas dimensões (2D) que não têm a capacidade de recapitular algumas das características in vivo, tais como as interações com a matriz extracelular e a geometria cilíndrica da microvasculatura encefálica. Para ultrapassar esta limitação, modelos tridimensionais (3D) foram implementados como forma de criar modelos que se aproximem mais das condições in vivo e, desta forma, aumentar a sua relevância fisiológica. Estes modelos são fabricados através da produção de canais incorporados em géis 3D, que são semeados com diferentes tipos de células, tais como células endoteliais, de forma a mimetizar as características in vivo. Dada a relevância científica deste tema, propusemo-nos desenvolver um modelo tridimensional da BHE. Este projeto teve assim três principais objetivos: (1) a fabricação de moldes da microvasculatura da BHE; (2) o estabelecimento das condições experimentais ideais para a formação de monocamadas de células endoteliais, recapitulando o endotélio da BHE; (3) e por fim a caracterização das suas propriedades. O primeiro passo do nosso trabalho passou pelo desenvolvimento de um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS). O PDMS foi devidamente preparado através da mistura de dois regentes (o agente de cura e a base) e seguidamente colocado num exsicador ligado a uma bomba de vácuo para retirar as bolhas de ar presentes na mistura. Uma vez sem bolhas, o PDMS foi colocado num molde metálico, solidificando a 70º C, durante 2 horas. Este dispositivo foi devidamente cortado e foram abertas portas com tamanhos, localizações e funções diferentes. As portas de entrada e saída, localizadas na zona inicial e final do microvaso, respetivamente, correspondem ao local onde ocorre a perfusão de células e onde é implementado um fluxo continuo de solução dentro do vaso. Por outro lado, as portas de agarose, localizadas a uma distância de 1,4 cm de distância das portas de entrada e de saída, são o local onde são inseridos tanto o gel de colagénio, responsável por replicar a matriz extracelular, como a agarose, que irá dar suporte ao gel, de forma a este não perder a sua estrutura. Posteriormente à preparação e limpeza do dispositivo, é inserida uma agulha (150 µm de diâmetro) que irá ser o molde para o microvaso. A primeira otimização deste trabalho foi relativa à concentração do gel de colagénio usada. Foram testadas diferentes concentrações de colagénio de forma que fosse possível criar um canal dentro do gel capaz de manter a sua estrutura uma vez removida a agulha. De entre as concentrações testadas (1, 3, 5 e 7 mg/mL), apenas a concentração mais elevada permitiu obter um canal capaz de manter a sua estrutura, aquando da injeção da suspensão de células. A segunda otimização realizada foi referente ao tempo necessário para a hidratação do gel de colagénio. Inicialmente, realizou-se uma hidratação do gel com o meio de cultura de células, por um período de 20 minutos. No entanto, após a sua perfusão, as células não se encontravam aderentes ao gel e apresentavam uma morfologia arredondada. Assim, aumentou-se o tempo de hidratação para cerca de 90 minutos, e após este período, as células já se encontravam aderentes ao gel de colagénio, apresentando uma morfologia mais alongada característica das células endoteliais. De seguida, otimizou-se a concentração de células na perfusão, com o objetivo de obter um maior número de células aderentes e diminuir o tempo necessário para se obter um microvaso confluente. Conclui-se com os nossos resultados que, utilizando uma densidade celular de 3x106 e 20x106 células/mL, era possível obter microvasos com células endoteliais confluentes em cerca de 5-6 dias e 2 dias, respetivamente. Através da análise por imunofluorescência da proteína dos complexos juncionais, β-catenina, avaliou-se a formação das junções intercelulares, bem como a integridade dos microvasos. Concluiu-se que a densidade mais elevada resultava numa maior expressão de β-catenina ao longo do plano equatorial, num maior número de células por cada secção de 700 µm do microvaso, e num menor número de zonas com ausência de células. No entanto, a expressão da proteína estava maioritariamente presente a nível citoplasmático, e não na zona membranar como seria de esperar duma proteína juncional. Uma vez que em estudos já realizados está descrito que o fluxo a que as células são sujeitas, que cria uma tensão de cisalhamento dentro do microvaso, influencia não só a expressão das proteínas dos complexos juncionais, mas também a morfologia das mesmas, o fluxo que antes era de 0.2 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 1-2 dynes/cm2) induzido por uma bomba de seringa, foi aumentado para um fluxo mais próximo do fisiológico, de 0.5 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 4-6 dynes/cm2). A indução deste fluxo foi realizada quer por uma bomba de seringa, quer por gravidade, onde se induziu uma diferença de altura entre dois reservatórios, um em cada porta de entrada e saída, criando um fluxo dentro do microvaso. Novamente, através de análise por imunofluorescência verificou-se que com o aumento do fluxo, a expressão de β-catenina na membrana aumentou. Para além disso, realizou-se uma análise comparativa relativamente às diferenças a nível da morfologia celular entre os diferentes fluxos. Foi possível verificar que as células sujeitas a um fluxo mais elevado apresentavam uma morfologia mais alongada comparativamente com o fluxo mais baixo, onde as células apresentavam uma forma mais arredondada. Desta forma, concluiu-se que o aumento do fluxo levou a uma elevada expressão de proteínas presentes na membrana e a uma alteração significativa na morfologia das células. Foram também iniciados estudos com o objetivo de analisar a permeabilidade dos microvasos. Para este efeito, foi utilizada a fluoresceína sódica, uma substância com um tamanho reduzido, capaz de atravessar o microvaso por via paracelular. Nestes estudos foi avaliada a passagem de fluoresceína com base na análise da sua presença no colagénio por microscopia de fluorescência. No futuro, será interessante otimizar as condições experimentais de modo a obter uma melhor localização membranar de proteínas juncionais tais como a β-catenina e a zonula occludens-1. Para atingir este objetivo, antevê-se que seja necessário aumentar o fluxo, uma vez que se sabe que tem influência na interação entre as células. Um outro teste será enriquecer o meio de cultura das células com proteínas que possam induzir a formação dos complexos juncionais, como o cAMP e a hidrocortisona. Além disso, devem ser realizados testes de permeabilidade utilizando moléculas maiores para avaliar o limiar de permeabilidade do endotélio, para uma caracterização mais robusta dos microvasos. Finalmente, será interessante usar este modelo para estudar o mecanismo subjacente à formação de metástases encefálicas, juntamente com o processo de extravasamento que ocorre durante a cascata metastática do cancro da mama, que tem sido intensamente estudado no nosso grupo. Dada a importância da BHE para a proteção do encéfalo contra diferentes moléculas prejudiciais e o fornecimento de nutrientes, tendo um papel importante em doenças neuronais específicas, é essencial aumentar o conhecimento já existente sobre a funcionalidade da BHE e ter uma melhor compreensão das suas características. Assim, através da construção de um modelo 3D da vasculatura encefálica que permita recapitular a função e propriedades in vivo da BHE, este projeto abre caminho para estudos mais robustos da BHE, constituindo uma ferramenta inestimável na compreensão dos mecanismos celulares associados ao desenvolvimento de perturbações do sistema nervoso central. |
|---|---|
| Autores principais: | Ferreira, Catarina Oliveira |
| Assunto: | Tissue engineering Blood-brain barrier 3D in vitro model Microfluidic platform Microvessel Shear stress Teses de mestrado - 2023 |
| Ano: | 2023 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
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| author | Ferreira, Catarina Oliveira |
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Para ultrapassar esta limitação, modelos tridimensionais (3D) foram implementados como forma de criar modelos que se aproximem mais das condições in vivo e, desta forma, aumentar a sua relevância fisiológica. Estes modelos são fabricados através da produção de canais incorporados em géis 3D, que são semeados com diferentes tipos de células, tais como células endoteliais, de forma a mimetizar as características in vivo. Dada a relevância científica deste tema, propusemo-nos desenvolver um modelo tridimensional da BHE. Este projeto teve assim três principais objetivos: (1) a fabricação de moldes da microvasculatura da BHE; (2) o estabelecimento das condições experimentais ideais para a formação de monocamadas de células endoteliais, recapitulando o endotélio da BHE; (3) e por fim a caracterização das suas propriedades. O primeiro passo do nosso trabalho passou pelo desenvolvimento de um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS). O PDMS foi devidamente preparado através da mistura de dois regentes (o agente de cura e a base) e seguidamente colocado num exsicador ligado a uma bomba de vácuo para retirar as bolhas de ar presentes na mistura. Uma vez sem bolhas, o PDMS foi colocado num molde metálico, solidificando a 70º C, durante 2 horas. Este dispositivo foi devidamente cortado e foram abertas portas com tamanhos, localizações e funções diferentes. As portas de entrada e saída, localizadas na zona inicial e final do microvaso, respetivamente, correspondem ao local onde ocorre a perfusão de células e onde é implementado um fluxo continuo de solução dentro do vaso. Por outro lado, as portas de agarose, localizadas a uma distância de 1,4 cm de distância das portas de entrada e de saída, são o local onde são inseridos tanto o gel de colagénio, responsável por replicar a matriz extracelular, como a agarose, que irá dar suporte ao gel, de forma a este não perder a sua estrutura. Posteriormente à preparação e limpeza do dispositivo, é inserida uma agulha (150 µm de diâmetro) que irá ser o molde para o microvaso. A primeira otimização deste trabalho foi relativa à concentração do gel de colagénio usada. Foram testadas diferentes concentrações de colagénio de forma que fosse possível criar um canal dentro do gel capaz de manter a sua estrutura uma vez removida a agulha. De entre as concentrações testadas (1, 3, 5 e 7 mg/mL), apenas a concentração mais elevada permitiu obter um canal capaz de manter a sua estrutura, aquando da injeção da suspensão de células. A segunda otimização realizada foi referente ao tempo necessário para a hidratação do gel de colagénio. Inicialmente, realizou-se uma hidratação do gel com o meio de cultura de células, por um período de 20 minutos. No entanto, após a sua perfusão, as células não se encontravam aderentes ao gel e apresentavam uma morfologia arredondada. Assim, aumentou-se o tempo de hidratação para cerca de 90 minutos, e após este período, as células já se encontravam aderentes ao gel de colagénio, apresentando uma morfologia mais alongada característica das células endoteliais. De seguida, otimizou-se a concentração de células na perfusão, com o objetivo de obter um maior número de células aderentes e diminuir o tempo necessário para se obter um microvaso confluente. Conclui-se com os nossos resultados que, utilizando uma densidade celular de 3x106 e 20x106 células/mL, era possível obter microvasos com células endoteliais confluentes em cerca de 5-6 dias e 2 dias, respetivamente. Através da análise por imunofluorescência da proteína dos complexos juncionais, β-catenina, avaliou-se a formação das junções intercelulares, bem como a integridade dos microvasos. Concluiu-se que a densidade mais elevada resultava numa maior expressão de β-catenina ao longo do plano equatorial, num maior número de células por cada secção de 700 µm do microvaso, e num menor número de zonas com ausência de células. No entanto, a expressão da proteína estava maioritariamente presente a nível citoplasmático, e não na zona membranar como seria de esperar duma proteína juncional. Uma vez que em estudos já realizados está descrito que o fluxo a que as células são sujeitas, que cria uma tensão de cisalhamento dentro do microvaso, influencia não só a expressão das proteínas dos complexos juncionais, mas também a morfologia das mesmas, o fluxo que antes era de 0.2 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 1-2 dynes/cm2) induzido por uma bomba de seringa, foi aumentado para um fluxo mais próximo do fisiológico, de 0.5 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 4-6 dynes/cm2). A indução deste fluxo foi realizada quer por uma bomba de seringa, quer por gravidade, onde se induziu uma diferença de altura entre dois reservatórios, um em cada porta de entrada e saída, criando um fluxo dentro do microvaso. Novamente, através de análise por imunofluorescência verificou-se que com o aumento do fluxo, a expressão de β-catenina na membrana aumentou. Para além disso, realizou-se uma análise comparativa relativamente às diferenças a nível da morfologia celular entre os diferentes fluxos. Foi possível verificar que as células sujeitas a um fluxo mais elevado apresentavam uma morfologia mais alongada comparativamente com o fluxo mais baixo, onde as células apresentavam uma forma mais arredondada. Desta forma, concluiu-se que o aumento do fluxo levou a uma elevada expressão de proteínas presentes na membrana e a uma alteração significativa na morfologia das células. Foram também iniciados estudos com o objetivo de analisar a permeabilidade dos microvasos. Para este efeito, foi utilizada a fluoresceína sódica, uma substância com um tamanho reduzido, capaz de atravessar o microvaso por via paracelular. Nestes estudos foi avaliada a passagem de fluoresceína com base na análise da sua presença no colagénio por microscopia de fluorescência. No futuro, será interessante otimizar as condições experimentais de modo a obter uma melhor localização membranar de proteínas juncionais tais como a β-catenina e a zonula occludens-1. Para atingir este objetivo, antevê-se que seja necessário aumentar o fluxo, uma vez que se sabe que tem influência na interação entre as células. Um outro teste será enriquecer o meio de cultura das células com proteínas que possam induzir a formação dos complexos juncionais, como o cAMP e a hidrocortisona. Além disso, devem ser realizados testes de permeabilidade utilizando moléculas maiores para avaliar o limiar de permeabilidade do endotélio, para uma caracterização mais robusta dos microvasos. Finalmente, será interessante usar este modelo para estudar o mecanismo subjacente à formação de metástases encefálicas, juntamente com o processo de extravasamento que ocorre durante a cascata metastática do cancro da mama, que tem sido intensamente estudado no nosso grupo. Dada a importância da BHE para a proteção do encéfalo contra diferentes moléculas prejudiciais e o fornecimento de nutrientes, tendo um papel importante em doenças neuronais específicas, é essencial aumentar o conhecimento já existente sobre a funcionalidade da BHE e ter uma melhor compreensão das suas características. Assim, através da construção de um modelo 3D da vasculatura encefálica que permita recapitular a função e propriedades in vivo da BHE, este projeto abre caminho para estudos mais robustos da BHE, constituindo uma ferramenta inestimável na compreensão dos mecanismos celulares associados ao desenvolvimento de perturbações do sistema nervoso central. |
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Para ultrapassar esta limitação, modelos tridimensionais (3D) foram implementados como forma de criar modelos que se aproximem mais das condições in vivo e, desta forma, aumentar a sua relevância fisiológica. Estes modelos são fabricados através da produção de canais incorporados em géis 3D, que são semeados com diferentes tipos de células, tais como células endoteliais, de forma a mimetizar as características in vivo. Dada a relevância científica deste tema, propusemo-nos desenvolver um modelo tridimensional da BHE. Este projeto teve assim três principais objetivos: (1) a fabricação de moldes da microvasculatura da BHE; (2) o estabelecimento das condições experimentais ideais para a formação de monocamadas de células endoteliais, recapitulando o endotélio da BHE; (3) e por fim a caracterização das suas propriedades. O primeiro passo do nosso trabalho passou pelo desenvolvimento de um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS). O PDMS foi devidamente preparado através da mistura de dois regentes (o agente de cura e a base) e seguidamente colocado num exsicador ligado a uma bomba de vácuo para retirar as bolhas de ar presentes na mistura. Uma vez sem bolhas, o PDMS foi colocado num molde metálico, solidificando a 70º C, durante 2 horas. Este dispositivo foi devidamente cortado e foram abertas portas com tamanhos, localizações e funções diferentes. As portas de entrada e saída, localizadas na zona inicial e final do microvaso, respetivamente, correspondem ao local onde ocorre a perfusão de células e onde é implementado um fluxo continuo de solução dentro do vaso. Por outro lado, as portas de agarose, localizadas a uma distância de 1,4 cm de distância das portas de entrada e de saída, são o local onde são inseridos tanto o gel de colagénio, responsável por replicar a matriz extracelular, como a agarose, que irá dar suporte ao gel, de forma a este não perder a sua estrutura. Posteriormente à preparação e limpeza do dispositivo, é inserida uma agulha (150 µm de diâmetro) que irá ser o molde para o microvaso. A primeira otimização deste trabalho foi relativa à concentração do gel de colagénio usada. Foram testadas diferentes concentrações de colagénio de forma que fosse possível criar um canal dentro do gel capaz de manter a sua estrutura uma vez removida a agulha. De entre as concentrações testadas (1, 3, 5 e 7 mg/mL), apenas a concentração mais elevada permitiu obter um canal capaz de manter a sua estrutura, aquando da injeção da suspensão de células. A segunda otimização realizada foi referente ao tempo necessário para a hidratação do gel de colagénio. Inicialmente, realizou-se uma hidratação do gel com o meio de cultura de células, por um período de 20 minutos. No entanto, após a sua perfusão, as células não se encontravam aderentes ao gel e apresentavam uma morfologia arredondada. Assim, aumentou-se o tempo de hidratação para cerca de 90 minutos, e após este período, as células já se encontravam aderentes ao gel de colagénio, apresentando uma morfologia mais alongada característica das células endoteliais. De seguida, otimizou-se a concentração de células na perfusão, com o objetivo de obter um maior número de células aderentes e diminuir o tempo necessário para se obter um microvaso confluente. Conclui-se com os nossos resultados que, utilizando uma densidade celular de 3x106 e 20x106 células/mL, era possível obter microvasos com células endoteliais confluentes em cerca de 5-6 dias e 2 dias, respetivamente. Através da análise por imunofluorescência da proteína dos complexos juncionais, β-catenina, avaliou-se a formação das junções intercelulares, bem como a integridade dos microvasos. Concluiu-se que a densidade mais elevada resultava numa maior expressão de β-catenina ao longo do plano equatorial, num maior número de células por cada secção de 700 µm do microvaso, e num menor número de zonas com ausência de células. No entanto, a expressão da proteína estava maioritariamente presente a nível citoplasmático, e não na zona membranar como seria de esperar duma proteína juncional. Uma vez que em estudos já realizados está descrito que o fluxo a que as células são sujeitas, que cria uma tensão de cisalhamento dentro do microvaso, influencia não só a expressão das proteínas dos complexos juncionais, mas também a morfologia das mesmas, o fluxo que antes era de 0.2 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 1-2 dynes/cm2) induzido por uma bomba de seringa, foi aumentado para um fluxo mais próximo do fisiológico, de 0.5 mL/h (correspondendo a uma tensão de cisalhamento de 4-6 dynes/cm2). A indução deste fluxo foi realizada quer por uma bomba de seringa, quer por gravidade, onde se induziu uma diferença de altura entre dois reservatórios, um em cada porta de entrada e saída, criando um fluxo dentro do microvaso. Novamente, através de análise por imunofluorescência verificou-se que com o aumento do fluxo, a expressão de β-catenina na membrana aumentou. Para além disso, realizou-se uma análise comparativa relativamente às diferenças a nível da morfologia celular entre os diferentes fluxos. Foi possível verificar que as células sujeitas a um fluxo mais elevado apresentavam uma morfologia mais alongada comparativamente com o fluxo mais baixo, onde as células apresentavam uma forma mais arredondada. Desta forma, concluiu-se que o aumento do fluxo levou a uma elevada expressão de proteínas presentes na membrana e a uma alteração significativa na morfologia das células. Foram também iniciados estudos com o objetivo de analisar a permeabilidade dos microvasos. 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Finalmente, será interessante usar este modelo para estudar o mecanismo subjacente à formação de metástases encefálicas, juntamente com o processo de extravasamento que ocorre durante a cascata metastática do cancro da mama, que tem sido intensamente estudado no nosso grupo. Dada a importância da BHE para a proteção do encéfalo contra diferentes moléculas prejudiciais e o fornecimento de nutrientes, tendo um papel importante em doenças neuronais específicas, é essencial aumentar o conhecimento já existente sobre a funcionalidade da BHE e ter uma melhor compreensão das suas características. 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