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Influence of histone octamer core distortion on nucleosome thermal mobility

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O nucleossoma é a subunidade fundamental da cromatina eucariótica. As histonas, proteínas características do nucleossoma, são pequenas proteínas básicas subdivididas em duas superfamílias: linker (H1) e core (H2A, H2B, H3 e H4). As histonas core oligomerizam para formar o octamero de histonas que, conjuntamente com ADN de cadeia dupla, estabelecem a estrutura complexa do nucleossoma. A estrutura do nucleossoma foi inicialmente identificada em 1975 recorrendo à digestão da cromatina por uma nuclease micrococal, sendo que apenas em 1997 foi divulgada a estrutura do nucleossoma obtida por difração de raios-X com uma resolução de 2.8 Å, e mais tarde, em 2002, com uma resolução de 1.9 Å, o que revela ser mais do que suficiente para as cadeias laterais e a cadeia principal serem observadas com elevado grau de confiança. As histonas partilham um domínio entre elas: o histone fold, constituído por cerca de 70 resíduos de aminoácidos, capaz de facilitar a heterodimerização das histonas e que se encontra localizado na região C-terminal e consiste em três hélices-α (α1, α2 e α3) ligadas entre si por dois loops (L1 e L2) flanqueando a hélice-α 2. As histonas são constituídas por um domínio globular e uma região N-terminal flexível rica em resíduos de lisina e arginina. Estas proteínas heterodimerizam com o auxílio de interações hidrofóbicas, formando o handshake motif. No contexto celular, o nucleossoma permite o empacotamento do genoma no espaço relativamente limitado disponível dentro do núcleo, através do folding numa série de estruturas moleculares de ordem gradualmente superior. Mais ainda, permite a regulação temporal e espacial de vários processos modelados pelo ADN, como por exemplo a transcrição, a replicação e o reparo de ADN, necessários para que as células prosperem e exerçam as suas funções. Desde a sua descoberta na década de 1960, as modificações pós-tradicionais de histonas (e.g. metilação, fosforilação e acetilação) foram associadas à regulação da expressão génica, com algumas modificações sendo associadas à ativação de genes, enquanto outras foram associadas ao seu silenciamento. Vários estudos demonstraram a existência de um “código de histonas” que estipula que diferentes modificações pós-tradicionais nas histonas afetam as afinidades de ligação de proteínas capazes de estabelecerem uma ligação à cromatina, levando a estados transcricionais alterados do ADN subjacente. A informação epigenética codificada por estas modificações que ocorrem nas histonas pode ser passada para a próxima geração de células, agindo como uma camada adicional de informação que pode ser armazenada dentro da célula, aumentando ainda mais a complexidade e a variabilidade do material genético. Foi previamente demonstrado que o nucleossoma exibe um deslocamento, quando incubado a altas temperaturas, para os terminais da molécula de ADN que está enrolada em volta do nucleossoma. Neste contexto, o presente projeto visa observar a influência da distorção do octamero de histonas na mobilidade térmica do nucleossoma. Deste modo, vários mutantes de histonas foram preparados, embora apenas um nucleossoma mutante tenha sido gerado, além do nucleossoma wild-type. Para a obtenção de histonas recombinantes com elevado grau de pureza, recorreu-se a técnicas cromatográficas. Em primeiro lugar, foram expressas histonas recombinantes (wild-type e mutantes) em células Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta competentes a partir de plasmídeos in house. As histonas core H2A e H2B, bem como H3 e H4, foram coexpressas, uma vez que a coexpressão destes dois pares de proteínas reduz o tempo necessário para a sua síntese, para além de produzir complexos solúveis passíveis de serem purificados por sucessivas técnicas experimentais. Posteriormente, executou-se a purificação das mesmas através do uso de uma cromatografia de afinidade seguida duma cromatografia de troca iónica. Após todas as histonas terem sido geradas em grandes quantidades e elevado grau de pureza, efetuou-se a montagem do octamero. Paralelamente, foi sintetizada a sequência Widom 601, previamente descrita na literatura como sendo uma sequência de muito alta afinidade para o nucleossoma, via PCR usando primers apropriados. Neste trabalho foram geradas duas variantes da sequência supramencionada: curta (147 pb) e longa (227 pb). Uma vez obtidos todos os componentes necessários para a montagem do nucleossoma, recorreu-se à reconstituição do mesmo através de diálises (com gradiente de salinidade). Por fim, os nucleossomas gerados foram usados para serem efetuados thermal shift assays e native gel shift assays. Os thermal shift assays foram usados para se observar o deslocamento do nucleossoma ao longo do ADN (baseado na sequência Widom 601) e o efeito da distorção do octamero na mobilidade do nucleossoma induzida pela temperatura. Quanto aos native gel shift assays, um ensaio experimental rápido e sensível para a deteção de interações proteína-ácido nucleico, foram usados para observar a afinidade de ligação de diversas proteínas com ligação putativa à cromatina. Este trabalho corroborou o padrão observado de deslocamento de nucleossomas wild-type para as extremidades do ADN associado ao mesmo. O nucleossoma mutante H4_V43C H3_F104C concebido neste projeto demonstrou estar associado ao aumento da integridade estrutural e rigidez do nucleossoma, possivelmente através do estabelecimento de uma ponte dissulfeto entre L1 (loop 1) da histona H4 e 2 (hélice- 2) da histona H3. O estudo do impacto da plasticidade do octamero de histonas, consequência das diversas modificações que podem ocorrer nos seus resíduos de aminoácidos e que levam à distorção do core de histonas, é relevante no sentido de tentar entender o seu papel na regulação da expressão génica. Uma dada mutação irá, hipoteticamente, reforçar a estrutura do nucleossoma, potencialmente impossibilitando o acesso do complexo basal de transcrição, devido à alteração da capacidade de mobilidade do nucleossoma em relação ao ADN, e silenciando o(s) gene(s) codificados no ADN subjacente que se encontra “blindado” pelo nucleossoma, e vice-versa. Também será possível que alguns complexos capazes de remodelar a cromatina possam tirar partido da alteração da integridade estrutural conferida pelas diversas mutações ou pela presença de variantes de histonas. Numa visão geral, os resultados obtidos neste projeto demonstraram que é necessária uma certa plasticidade do octamero de histonas para se observar o movimento não-catalisado do nucleossoma. Adicionalmente, foi tentada a análise da Fkbp39, uma peptidilprolil isomerase com um domínio NPL (nucleoplasmin-like) conservado na região N-terminal, que se pensa ser uma chaperona de histonas em S. pombe e que é responsável pelo aumento da taxa de isomerização cis-trans das prolinas na cauda N-terminal (região N-terminal flexível) da histona H3. A análise foi feita por criomicroscopia eletrónica, tanto com a Fkbp39 não-complexada, como em complexo com (H2A-H2B) e com (H3-H4)2. Nesse sentido, expressou-se a proteína Fkbp39 em células E. coli BL21 (DE3) Rosetta competentes e foi executada a sua purificação com elevado grau de pureza através do uso de diferentes técnicas cromatográficas (cromatografias de afinidade, de troca iónica, e de exclusão molecular). Embora as purificações tenham sido bem-sucedidas, nem a proteína Fkbp39 isolada, nem em complexo com o dímero (H2A-H2B) ou com o tetramero (H3-H4)2 foram passíveis de serem observadas por criomicroscopia electrónica. É possível que, devido à presença de uma região central dinâmica intrinsecamente desordenada, estratégias sucessivas de otimização sejam necessárias para estabilizar os complexos putativos. Por último, várias proteínas putativas de ligação à cromatina foram rastreadas quanto à ligação aos nucleossomas sintetizados neste projeto recorrendo a native gel shift assays. Hpf1 (Histone PARylation factor 1), Parp2 (Poly [ADP-ribose] polymerase 2) e Alf (TFIIA-alpha and beta-like factor), provenientes de Homo sapiens, demonstraram ser os melhores candidatos para estudos estruturais posteriores mais aprofundados para averiguar com maior confiança as suas afinidades de ligação à cromatina.
Autores principais:	Cirilo, Alexandre Dias
Assunto:	Nucleossoma Código de histonas Modificações pós-traducionais Epigenética Cromatina Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa