Publicação
Recovery of cyanobacterial draft genomes from a metagenome dataset: applications to the detection of antibiotic resistance variants
| Resumo: | As cianobactérias são um dos grupos de organismos mais amplamente distribuídos nos corpos de água doce continentais, apresentando uma distribuição global. O processo evolutivo a que este grupo esteve sujeito conferiu-lhes uma grande diversidade de cores, formas e estruturas organizacionais de comunidade, fazendo com que os organismos deste filo possam ser bastante diferentes entre si, tanto a nível fenotípico como genotípico. Os géneros Planktothrix, Microcystis, Anabaena e Aphanizomenon são dos grupos de cianobactérias mais presentes nos corpos de água doce portugueses. Apesar de frequentemente estudadas devido ao seu potencial farmacêutico e biotecnológico e à sua capacidade de formar blooms nocivos, as cianobactérias (principalmente de água doce) foram até agora pouco estudadas no que diz respeito à sua contribuição para o resistoma aquático. A resistência a antibióticos em organismos patogénicos é um problema cada vez mais prevalecente e que coloca em risco não só a saúde humana, como animal. No entanto, não são apenas os microrganismos com relevância clínica que apresentam mecanismos de RA. Os microrganismos ambientais, como as cianobactérias, podem ter também um papel importante na emergência e disseminação dos genes de resistência, pelo que a análise exploratória dos seus genomas se revela de grande importância. Este trabalho teve como principais objetivos, i) a classificação taxonómica e assemblagem de reads provenientes de culturas não-axénicas de cianobactérias, ii) a deteção da presença de genes capazes de conferir resistência a antibióticos nos genomas cianobacterianos e finalmente iii) o desenvolvimento de uma pipeline escalável e reprodutível que permita aplicar de forma simples o workflow desenvolvido. Foram utilizadas tecnologias de sequenciação de segunda geração (Illumina) para sequenciar 43 estirpes de cianobactérias não-axénicas, provenientes de amostras recolhidas em reservatórios de água e numa estação de tratamento de águas residuais, distribuídas ao longo de Portugal continental. Todas estas amostras pertencem à Coleção de Culturas de Algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) ou à Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE-CC). As estirpes analisadas foram previamente classificadas taxonomicamente com base em observações de microscopia, sendo 8 delas classificadas como Planktothrix agardhii, 8 como Planktothrix mougeotii, 9 como Microcystis aeruginosa, 9 como Anabaena spp. e 9 como Aphanizomenon spp. Os dados resultantes da sequenciação das culturas foram tratados de modo a garantir a sua qualidade e eliminar as sequências adaptadoras resultantes do processo de sequenciação. Foram observadas as curvas de conteúdo GC de cada uma das amostras de modo a descriminar as cianobactérias das restantes bactérias da comunidade. Devido ao elevado conteúdo de organismos não cianobacterianos foi seguida uma abordagem de binning metagenómico de modo a obter genomas isolados das cianobactérias de interesse. Numa primeira etapa os metagenomas foram classificados taxonomicamente com recurso ao software Kraken2, o que nos permitiu corroborar ou corrigir a classificação taxonómica prévia das amostras das coleções quanto à espécie de cianobactéria predominante em cada uma das culturas. Esta classificação permitiu-nos também identificar os restantes organismos presentes no meio, que consistem maioritariamente em bactérias pertencentes aos filos Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes e Phragmoplastophyta. Conhecendo a taxonomia das amostras foi efetuada a assemblagem do metagenoma com recurso ao software SPAdes. Os metagenomas assemblados foram posteriormente ‘binned’ em diversos ficheiros fasta de acordo com a sua cobertura genómica e percentagem de conteúdo GC, cada um teoricamente correspondente a uma espécie de bactéria. Os bins pertencentes a espécies de cianobactérias foram selecionados automaticamente por um script em Python desenvolvido para o propósito, com base nas informações de percentagem de bases GC e dimensões genómicas de amostras de referência do NCBI, de géneros correspondentes aos identificados pelo Kraken2. Os genomas (bins) cianobacterianos foram então analisados relativamente à presença de potenciais genes de resistência a antibióticos (RA), através da comparação das suas sequências com as sequências de referência de genes de RA presentes na base de dados CARD, utilizando a ferramenta online associada à mesma, o Resistance Gene Identifier (RGI). Os restantes bins, pertencentes outros grupos de bactérias, foram também pesquisados para genes de RA de modo a tentar caracterizar os resistomas aquáticos e identificar indícios de transferência horizontal de genes. Deste modo, foi detetada a presença do gene adeF em 25 amostras pertencentes a diferentes géneros e recolhidas em pontos de amostragem diferentes. Dez das 25 ocorrências deste gene foram detetadas em genomas cianobacterianos. Este gene é conhecido por contribuir para o fénotipo de resistências a fluoroquinolonas e tetraciclinas. A deteção conjunta dos genes mphG e mefC também foi interessante, uma vez que já existia uma descrição da transmissão conjunta destes genes em bactérias de água salgada, mas nunca em cianobactérias de água doce. Ambos os genes conferem resistência a antibióticos da classe dos macrolidos, e os seus efeitos foram descritos como mutuamente potenciadores, dando origem a um fenótipo de elevada resistência. A descoberta de múltiplas cópias de genes de resistência semelhantes, presentes em vários organismos de espécies diferentes recolhidos do mesmo local, indicia para a possibilidade da transferência horizontal de genes ser um dos mecanismos importantes na rápida adaptação das comunidades microbianas de água doce. Foram também detetadas quantidades elevadas de hits parciais de genes de resistência em todas as amostras. As informações quanto às classes de antibióticos sobre as quais atuam estes genes parciais podem servir de base para próximos estudos de concentração inibitória mínima realizados em laboratório. Com estes resultados obtêm-se então novos indícios de que, devido à sua capacidade de transferência de genes e à presença de genes de RA nos seus genomas, as cianobactérias podem ser consideradas prováveis reservatórios de genes de resistência nas comunidades dulceaquicolas em que se inserem. No decorrer deste trabalho foi também desenvolvida uma pipeline em GNU Make e Shell Script, denominada CyanoPipeline (https://github.com/Duartb/cyano_pipeline), que facilitou a aplicação de uma elevada quantidade de passos repetitivos a um grande número de amostras e ajudou a aumentar a reprodutibilidade do trabalho realizado. |
|---|---|
| Autores principais: | Balata, Duarte Teomoteo |
| Assunto: | Cianobactéria Resistência a antibióticos Sequenciação de genoma completo Metagenómica Pipeline bioinformática ARG Teses de mestrado - 2020 |
| Ano: | 2020 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
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A resistência a antibióticos em organismos patogénicos é um problema cada vez mais prevalecente e que coloca em risco não só a saúde humana, como animal. No entanto, não são apenas os microrganismos com relevância clínica que apresentam mecanismos de RA. Os microrganismos ambientais, como as cianobactérias, podem ter também um papel importante na emergência e disseminação dos genes de resistência, pelo que a análise exploratória dos seus genomas se revela de grande importância. Este trabalho teve como principais objetivos, i) a classificação taxonómica e assemblagem de reads provenientes de culturas não-axénicas de cianobactérias, ii) a deteção da presença de genes capazes de conferir resistência a antibióticos nos genomas cianobacterianos e finalmente iii) o desenvolvimento de uma pipeline escalável e reprodutível que permita aplicar de forma simples o workflow desenvolvido. Foram utilizadas tecnologias de sequenciação de segunda geração (Illumina) para sequenciar 43 estirpes de cianobactérias não-axénicas, provenientes de amostras recolhidas em reservatórios de água e numa estação de tratamento de águas residuais, distribuídas ao longo de Portugal continental. Todas estas amostras pertencem à Coleção de Culturas de Algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) ou à Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE-CC). As estirpes analisadas foram previamente classificadas taxonomicamente com base em observações de microscopia, sendo 8 delas classificadas como Planktothrix agardhii, 8 como Planktothrix mougeotii, 9 como Microcystis aeruginosa, 9 como Anabaena spp. e 9 como Aphanizomenon spp. Os dados resultantes da sequenciação das culturas foram tratados de modo a garantir a sua qualidade e eliminar as sequências adaptadoras resultantes do processo de sequenciação. Foram observadas as curvas de conteúdo GC de cada uma das amostras de modo a descriminar as cianobactérias das restantes bactérias da comunidade. Devido ao elevado conteúdo de organismos não cianobacterianos foi seguida uma abordagem de binning metagenómico de modo a obter genomas isolados das cianobactérias de interesse. Numa primeira etapa os metagenomas foram classificados taxonomicamente com recurso ao software Kraken2, o que nos permitiu corroborar ou corrigir a classificação taxonómica prévia das amostras das coleções quanto à espécie de cianobactéria predominante em cada uma das culturas. Esta classificação permitiu-nos também identificar os restantes organismos presentes no meio, que consistem maioritariamente em bactérias pertencentes aos filos Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes e Phragmoplastophyta. Conhecendo a taxonomia das amostras foi efetuada a assemblagem do metagenoma com recurso ao software SPAdes. Os metagenomas assemblados foram posteriormente ‘binned’ em diversos ficheiros fasta de acordo com a sua cobertura genómica e percentagem de conteúdo GC, cada um teoricamente correspondente a uma espécie de bactéria. Os bins pertencentes a espécies de cianobactérias foram selecionados automaticamente por um script em Python desenvolvido para o propósito, com base nas informações de percentagem de bases GC e dimensões genómicas de amostras de referência do NCBI, de géneros correspondentes aos identificados pelo Kraken2. Os genomas (bins) cianobacterianos foram então analisados relativamente à presença de potenciais genes de resistência a antibióticos (RA), através da comparação das suas sequências com as sequências de referência de genes de RA presentes na base de dados CARD, utilizando a ferramenta online associada à mesma, o Resistance Gene Identifier (RGI). Os restantes bins, pertencentes outros grupos de bactérias, foram também pesquisados para genes de RA de modo a tentar caracterizar os resistomas aquáticos e identificar indícios de transferência horizontal de genes. Deste modo, foi detetada a presença do gene adeF em 25 amostras pertencentes a diferentes géneros e recolhidas em pontos de amostragem diferentes. Dez das 25 ocorrências deste gene foram detetadas em genomas cianobacterianos. Este gene é conhecido por contribuir para o fénotipo de resistências a fluoroquinolonas e tetraciclinas. A deteção conjunta dos genes mphG e mefC também foi interessante, uma vez que já existia uma descrição da transmissão conjunta destes genes em bactérias de água salgada, mas nunca em cianobactérias de água doce. Ambos os genes conferem resistência a antibióticos da classe dos macrolidos, e os seus efeitos foram descritos como mutuamente potenciadores, dando origem a um fenótipo de elevada resistência. A descoberta de múltiplas cópias de genes de resistência semelhantes, presentes em vários organismos de espécies diferentes recolhidos do mesmo local, indicia para a possibilidade da transferência horizontal de genes ser um dos mecanismos importantes na rápida adaptação das comunidades microbianas de água doce. Foram também detetadas quantidades elevadas de hits parciais de genes de resistência em todas as amostras. As informações quanto às classes de antibióticos sobre as quais atuam estes genes parciais podem servir de base para próximos estudos de concentração inibitória mínima realizados em laboratório. Com estes resultados obtêm-se então novos indícios de que, devido à sua capacidade de transferência de genes e à presença de genes de RA nos seus genomas, as cianobactérias podem ser consideradas prováveis reservatórios de genes de resistência nas comunidades dulceaquicolas em que se inserem. 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A resistência a antibióticos em organismos patogénicos é um problema cada vez mais prevalecente e que coloca em risco não só a saúde humana, como animal. No entanto, não são apenas os microrganismos com relevância clínica que apresentam mecanismos de RA. Os microrganismos ambientais, como as cianobactérias, podem ter também um papel importante na emergência e disseminação dos genes de resistência, pelo que a análise exploratória dos seus genomas se revela de grande importância. Este trabalho teve como principais objetivos, i) a classificação taxonómica e assemblagem de reads provenientes de culturas não-axénicas de cianobactérias, ii) a deteção da presença de genes capazes de conferir resistência a antibióticos nos genomas cianobacterianos e finalmente iii) o desenvolvimento de uma pipeline escalável e reprodutível que permita aplicar de forma simples o workflow desenvolvido. Foram utilizadas tecnologias de sequenciação de segunda geração (Illumina) para sequenciar 43 estirpes de cianobactérias não-axénicas, provenientes de amostras recolhidas em reservatórios de água e numa estação de tratamento de águas residuais, distribuídas ao longo de Portugal continental. Todas estas amostras pertencem à Coleção de Culturas de Algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) ou à Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE-CC). As estirpes analisadas foram previamente classificadas taxonomicamente com base em observações de microscopia, sendo 8 delas classificadas como Planktothrix agardhii, 8 como Planktothrix mougeotii, 9 como Microcystis aeruginosa, 9 como Anabaena spp. e 9 como Aphanizomenon spp. Os dados resultantes da sequenciação das culturas foram tratados de modo a garantir a sua qualidade e eliminar as sequências adaptadoras resultantes do processo de sequenciação. Foram observadas as curvas de conteúdo GC de cada uma das amostras de modo a descriminar as cianobactérias das restantes bactérias da comunidade. Devido ao elevado conteúdo de organismos não cianobacterianos foi seguida uma abordagem de binning metagenómico de modo a obter genomas isolados das cianobactérias de interesse. Numa primeira etapa os metagenomas foram classificados taxonomicamente com recurso ao software Kraken2, o que nos permitiu corroborar ou corrigir a classificação taxonómica prévia das amostras das coleções quanto à espécie de cianobactéria predominante em cada uma das culturas. Esta classificação permitiu-nos também identificar os restantes organismos presentes no meio, que consistem maioritariamente em bactérias pertencentes aos filos Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes e Phragmoplastophyta. Conhecendo a taxonomia das amostras foi efetuada a assemblagem do metagenoma com recurso ao software SPAdes. Os metagenomas assemblados foram posteriormente ‘binned’ em diversos ficheiros fasta de acordo com a sua cobertura genómica e percentagem de conteúdo GC, cada um teoricamente correspondente a uma espécie de bactéria. Os bins pertencentes a espécies de cianobactérias foram selecionados automaticamente por um script em Python desenvolvido para o propósito, com base nas informações de percentagem de bases GC e dimensões genómicas de amostras de referência do NCBI, de géneros correspondentes aos identificados pelo Kraken2. Os genomas (bins) cianobacterianos foram então analisados relativamente à presença de potenciais genes de resistência a antibióticos (RA), através da comparação das suas sequências com as sequências de referência de genes de RA presentes na base de dados CARD, utilizando a ferramenta online associada à mesma, o Resistance Gene Identifier (RGI). Os restantes bins, pertencentes outros grupos de bactérias, foram também pesquisados para genes de RA de modo a tentar caracterizar os resistomas aquáticos e identificar indícios de transferência horizontal de genes. Deste modo, foi detetada a presença do gene adeF em 25 amostras pertencentes a diferentes géneros e recolhidas em pontos de amostragem diferentes. Dez das 25 ocorrências deste gene foram detetadas em genomas cianobacterianos. Este gene é conhecido por contribuir para o fénotipo de resistências a fluoroquinolonas e tetraciclinas. A deteção conjunta dos genes mphG e mefC também foi interessante, uma vez que já existia uma descrição da transmissão conjunta destes genes em bactérias de água salgada, mas nunca em cianobactérias de água doce. Ambos os genes conferem resistência a antibióticos da classe dos macrolidos, e os seus efeitos foram descritos como mutuamente potenciadores, dando origem a um fenótipo de elevada resistência. 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