Publicação

Implementation of methodologies for Vibrio spp. detection in microalgae production

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As microalgas apresentam capacidade de produzir uma variedade de compostos de alto valor económico. Contudo, a contaminação das culturas com bactérias representa um problema critico na produção a escala industrial, uma vez que a presença de organismos potencialmente patogénicos pode impossibilitar a entrada dos produtos no mercado. De forma a estabelecer a qualidade da biomassa produzida, e de fundamental importância a implementação de métodos de deteção de possíveis contaminantes. O facto da bactéria vibrio se encontrar amplamente difundida em ambientes aquáticos torna-a num possível contaminante das culturas de microalgas. Devido a sua capacidade de infetar não só animais mas também seres humanos, as contaminações representam uma ameaça preocupante para a saúde humana. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus representam as espécies detetadas com maior frequência e responsáveis por um aumento mundial de infeções transmitidas por alimentos marinhos. A sua ausência na biomassa de microalgas produzida para alimentação e rações e crucial e, consequentemente, a sua detecção deve basear-se em métodos eficazes. Como consequência do aumento da produção de microalgas, o objetivo principal desta dissertação foi implementar métodos internos para detetar estas três espécies de Vibrio na biomassa de microalgas. O principal método testado consistiu na ISO (International Organization for Standardization) 21872-1: 2017, baseado na presença/ausência da bactéria, de forma a satisfazer a exigência dos clientes por um método oficial. O objetivo final foi inferir se compensa implementar as análises no laboratório da A4F ou se seria preferível solicitar a sua realização a um laboratório externo de referência. Primeiramente, foram implementadas as medidas de biossegurança requeridas para trabalhar com microrganismos de risco II no laboratório da A4F. As duas partes da ISO/TS 21872-1:2007 foram compiladas num único documento, a ISO 21872-1:2017, dedicada a deteção de V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus. Atendendo ao facto de todas as análises previamente realizadas pelo laboratório externo terem fornecido um resultado negativo para a deteção das espécies de Vibrio, era expetável a sua ausência na biomassa. Consequentemente, o objetivo era inferir o número de etapas necessárias para descartar falsos positivos. Para tal, as amostras analisadas foram previamente testadas pelo laboratório de referência como negativas. O método da ISO 21872-1:2017 compreendeu quatro etapas principais: enriquecimento seletivo, isolamento, identificação e confirmação. Os dois enriquecimentos seletivos sucessivos foram realizados em água peptonada salina alcalina (ASPW) e as posteriores etapas de isolamento e identificação consistiram no plaqueamento em TCBS e num segundo meio seletivo, CHROMagarTM. Em relação aos controlos positivos, as colonias obtidas em CHROMagarTM corresponderam ao esperado. Em TCBS, tirando o facto de as colonias de V. cholerae serem menores do que era descrito, V. cholerae e V. parahaemolyticus originaram colónias típicas. Contrariamente, as colónias de V. vulnificus apresentaram uma coloração amarela em detrimento de verde. Posteriormente, todos os controlos positivos foram confirmados por PCR e esta discrepância justificada pelo facto de algumas estirpes de V. vulnificus fermentarem sacarose, resultando na coloração amarela. Conclui-se assim que a fermentação de sacarose não representa um factor discriminatório. Não obstante, visto que o objetivo era detetar todas as espécies abrangidas pela ISO 21872-1:2017, o método não foi influenciado. Na análise das amostras, o enriquecimento seletivo seguido de plaqueamento em CHROMagarTM e TCBS demostrou menos seletividade do que declarado pelos fabricantes, considerando que permitiu o desenvolvimento de uma ampla gama de colonias de falsos positivos com dimensões iguais ou inferiores a 1 mm. Visto que o controlo positivo de V. cholerae apresentou colonias menores do que o expetável em TCBS, o tamanho das colonias típicas foi negligenciado como fator discriminatório e todas as colonias verdes e amarelas em TCBS e roxas ou azuis em CHROMagarTM prosseguiram para as etapas de confirmação, resultando num método demorado. Contudo, verificou-se realmente uma discrepância entre o tamanho das colonias da amostra (1 mm ou inferior) e o tamanho esperado (2 - 3 mm) em TCBS e apenas foram obtidos aglomerados roxos ou azuis em CHROMagarTM sem colonias isoladas. Essas evidências, aliadas ao facto de que V. cholerae apresentou colonias típicas em CHROMagarTM, poderiam indicar que essas colonias não eram as espécies de Vibrio em teste. Contudo, era necessário confirmação adicional. A etapa de confirmação consistiu nos testes de coloração de Gram, teste de oxidase e ausência/presença de células móveis. O genero Vibrio corresponde a bactérias Gram-negativas, oxidase positivas e com células móveis. Contudo, nem todos os controlos positivos apresentaram células móveis e, consequentemente, este teste tornou-se inviável. Adicionalmente, a incapacidade destes testes de eliminar todos os falsos positivos levou a omissão desta etapa, prosseguindo diretamente para PCR. A conclusão de todas as análises foi “Ausência de V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus, potencialmente enteropatogénicos, em 25 g da pasta de acordo com a ISO 21872-1: 2017”, coincidindo com os resultados fornecidos pelo laboratório externo de referência. Adicionalmente ao método oficial, o primer para o género Vibrio permitiu inferir que os contaminantes que originaram as colonias de falsos positivos nao pertenciam a este género. Alem disso, apesar do PCR realizado diretamente no enriquecimento secundário não ter detetado nenhuma das três espécies, revelou a presença do género Vibrio, demostrando limitações do método microbiológico. Contudo, considerando que nem todas as bactérias pertencentes ao género Vibrio são potencialmente patogénicas, isto não significava, obrigatoriamente, uma ameaça para a saúde humana. Com o objetivo de inferir se o elevado número de falsos positivos podia originar resultados falsos negativos para deteção de vibrio, a ultima etapa laboratorial consistiu em testar amostras artificialmente contaminadas com 10 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) e 100 UFC de cada espécie de Vibrio. Em ambos os meios, foram identificadas colonias típicas, com as dimensões expetáveis. Consequentemente, embora V. cholera tenha originado colonias menores em TCBS, esta espécie formou colonias típicas no segundo meio seletivo. O facto de V. cholerae ter originado colonias típicas em CHROMagarTM confirmou a sua maior eficácia e a importância da complementaridade entre os dois meios. Concluindo, embora haja um elevado numero de colonias de falsos positivos, a diferença de tamanho aliada a complementaridade dos meios permitiu detetar as três espécies de Vibrio e descartar falsos positivos, incluindo as colonias com menos de 1 mm em TCBS. Quanto a comparacao entre PCR realizado diretamente no segundo enriquecimento e o método oficial, apenas V. cholerae apresentou discrepância. Esta espécie foi detetada em CHROMagarTM, mas não foi detetada no enriquecimento. Isso demostra que nenhum método e ideal e que a realização de PCR diretamente em suspensões de enriquecimento não e, por si só, um método passível de substituir o método da ISO 21872-1: 2017. Por último, de forma a averiguar a viabilidade económica da realização das análises internamente, em detrimento da sua requisição a um laboratório de referencia, realizou-se a analise financeira do método. O custo da realização da análise no laboratório da A4F demostrou ser aproximadamente três vezes superior ao preço providenciado pelo laboratório externo. Como tal, não compensava financeiramente a implementação interna deste método. Como perspectivas futuras, e expetável o desenvolvimento e aprovação de novos métodos oficiais que poderão ser mais favoráveis economicamente. Paralelamente, considerando os recursos disponíveis, o segundo objetivo consistiu em utilizar sondas de hibridização fluorescente in situ (FISH), fornecidas pela Biomode SA, como método de deteção de V. vulnificus, V. parahaemolyticus e V. cholerae diretamente em amostras de cultura de microalgas. Durante a otimização do protocolo, um dos problemas enfrentados foi a autofluorescência da clorofila nas microalgas. Para solucionar este problema, o Negro Sudão B foi testado, com sucesso, como tratamento de redução da autofluorescência. De modo a inferir o limite de deteção do método, foi obtida a seguinte correlação entre UFC e Densidade Ótica (DO): UFC = (109) ・ (DO) + 7 ・ 108. Em seguida, as amostras de Nannochloropsis foram artificialmente contaminadas com diluições seriadas de concentrações conhecidas de V. parahaemolyticus. O limite de deteção obtido, 106 CFU mL-1, encontrou-se dentro do valor esperado em microscopia de fluorescência. Em todas as amostras testadas, vibrio nunca foi detetado em pastas de biomassa da A4F, possivelmente como consequência de Nannochloropsis apresentar capacidade de suprimir quantitativamente e qualitativamente o crescimento de algumas espécies de Vibrio. Deste modo, mesmo que vibrio estivesse presente, seria expetável que as UFC mL-1 permanecessem em valores reduzidos. Consequentemente, seria necessário uma etapa de enriquecimento, por exemplo em ASPW. Contudo, juntamente com o pré-requisito das etapas adicionais para inibição da autofluorescência das microalgas, o método demostrou ser demorado e com um limite de deteção acima dos valores esperados nas culturas. Portanto, a menos que vibrio se tornasse numa contaminação comum em culturas na A4F, não seria necessário a realização de análises de rotina. Adicionalmente, este método só poderia ser implementado como análise de rotina se as contaminações de vibrio apresentassem uma elevada carga bacteriana, considerando que teria de ser superior a 106 UFC mL-1 para ser detetado. Caso estas espécies de Vibrio fossem detetadas, as culturas seriam descartadas imediatamente, permitindo economizar futuros recursos em culturas que não poderiam ser comercializadas. Como perspetivas futuras, deveriam ser desenvolvidas sondas com diferentes fluorocromos, como por exemplo fluorescamina.
Autores principais:	Conde, Joana Barros Mendes Nazaré
Assunto:	Vibrio ISO/TS 21872:2007 ISO 21872-1:2017 FISH Microalgas Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As microalgas apresentam capacidade de produzir uma variedade de compostos de alto valor económico. Contudo, a contaminação das culturas com bactérias representa um problema critico na produção a escala industrial, uma vez que a presença de organismos potencialmente patogénicos pode impossibilitar a entrada dos produtos no mercado. De forma a estabelecer a qualidade da biomassa produzida, e de fundamental importância a implementação de métodos de deteção de possíveis contaminantes. O facto da bactéria vibrio se encontrar amplamente difundida em ambientes aquáticos torna-a num possível contaminante das culturas de microalgas. Devido a sua capacidade de infetar não só animais mas também seres humanos, as contaminações representam uma ameaça preocupante para a saúde humana. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus representam as espécies detetadas com maior frequência e responsáveis por um aumento mundial de infeções transmitidas por alimentos marinhos. A sua ausência na biomassa de microalgas produzida para alimentação e rações e crucial e, consequentemente, a sua detecção deve basear-se em métodos eficazes. Como consequência do aumento da produção de microalgas, o objetivo principal desta dissertação foi implementar métodos internos para detetar estas três espécies de Vibrio na biomassa de microalgas. O principal método testado consistiu na ISO (International Organization for Standardization) 21872-1: 2017, baseado na presença/ausência da bactéria, de forma a satisfazer a exigência dos clientes por um método oficial. O objetivo final foi inferir se compensa implementar as análises no laboratório da A4F ou se seria preferível solicitar a sua realização a um laboratório externo de referência. Primeiramente, foram implementadas as medidas de biossegurança requeridas para trabalhar com microrganismos de risco II no laboratório da A4F. As duas partes da ISO/TS 21872-1:2007 foram compiladas num único documento, a ISO 21872-1:2017, dedicada a deteção de V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus. Atendendo ao facto de todas as análises previamente realizadas pelo laboratório externo terem fornecido um resultado negativo para a deteção das espécies de Vibrio, era expetável a sua ausência na biomassa. Consequentemente, o objetivo era inferir o número de etapas necessárias para descartar falsos positivos. Para tal, as amostras analisadas foram previamente testadas pelo laboratório de referência como negativas. O método da ISO 21872-1:2017 compreendeu quatro etapas principais: enriquecimento seletivo, isolamento, identificação e confirmação. Os dois enriquecimentos seletivos sucessivos foram realizados em água peptonada salina alcalina (ASPW) e as posteriores etapas de isolamento e identificação consistiram no plaqueamento em TCBS e num segundo meio seletivo, CHROMagarTM. Em relação aos controlos positivos, as colonias obtidas em CHROMagarTM corresponderam ao esperado. Em TCBS, tirando o facto de as colonias de V. cholerae serem menores do que era descrito, V. cholerae e V. parahaemolyticus originaram colónias típicas. Contrariamente, as colónias de V. vulnificus apresentaram uma coloração amarela em detrimento de verde. Posteriormente, todos os controlos positivos foram confirmados por PCR e esta discrepância justificada pelo facto de algumas estirpes de V. vulnificus fermentarem sacarose, resultando na coloração amarela. Conclui-se assim que a fermentação de sacarose não representa um factor discriminatório. Não obstante, visto que o objetivo era detetar todas as espécies abrangidas pela ISO 21872-1:2017, o método não foi influenciado. Na análise das amostras, o enriquecimento seletivo seguido de plaqueamento em CHROMagarTM e TCBS demostrou menos seletividade do que declarado pelos fabricantes, considerando que permitiu o desenvolvimento de uma ampla gama de colonias de falsos positivos com dimensões iguais ou inferiores a 1 mm. Visto que o controlo positivo de V. cholerae apresentou colonias menores do que o expetável em TCBS, o tamanho das colonias típicas foi negligenciado como fator discriminatório e todas as colonias verdes e amarelas em TCBS e roxas ou azuis em CHROMagarTM prosseguiram para as etapas de confirmação, resultando num método demorado. Contudo, verificou-se realmente uma discrepância entre o tamanho das colonias da amostra (1 mm ou inferior) e o tamanho esperado (2 - 3 mm) em TCBS e apenas foram obtidos aglomerados roxos ou azuis em CHROMagarTM sem colonias isoladas. Essas evidências, aliadas ao facto de que V. cholerae apresentou colonias típicas em CHROMagarTM, poderiam indicar que essas colonias não eram as espécies de Vibrio em teste. Contudo, era necessário confirmação adicional. A etapa de confirmação consistiu nos testes de coloração de Gram, teste de oxidase e ausência/presença de células móveis. O genero Vibrio corresponde a bactérias Gram-negativas, oxidase positivas e com células móveis. Contudo, nem todos os controlos positivos apresentaram células móveis e, consequentemente, este teste tornou-se inviável. Adicionalmente, a incapacidade destes testes de eliminar todos os falsos positivos levou a omissão desta etapa, prosseguindo diretamente para PCR. A conclusão de todas as análises foi “Ausência de V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus, potencialmente enteropatogénicos, em 25 g da pasta de acordo com a ISO 21872-1: 2017”, coincidindo com os resultados fornecidos pelo laboratório externo de referência. Adicionalmente ao método oficial, o primer para o género Vibrio permitiu inferir que os contaminantes que originaram as colonias de falsos positivos nao pertenciam a este género. Alem disso, apesar do PCR realizado diretamente no enriquecimento secundário não ter detetado nenhuma das três espécies, revelou a presença do género Vibrio, demostrando limitações do método microbiológico. Contudo, considerando que nem todas as bactérias pertencentes ao género Vibrio são potencialmente patogénicas, isto não significava, obrigatoriamente, uma ameaça para a saúde humana. Com o objetivo de inferir se o elevado número de falsos positivos podia originar resultados falsos negativos para deteção de vibrio, a ultima etapa laboratorial consistiu em testar amostras artificialmente contaminadas com 10 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) e 100 UFC de cada espécie de Vibrio. Em ambos os meios, foram identificadas colonias típicas, com as dimensões expetáveis. Consequentemente, embora V. cholera tenha originado colonias menores em TCBS, esta espécie formou colonias típicas no segundo meio seletivo. O facto de V. cholerae ter originado colonias típicas em CHROMagarTM confirmou a sua maior eficácia e a importância da complementaridade entre os dois meios. Concluindo, embora haja um elevado numero de colonias de falsos positivos, a diferença de tamanho aliada a complementaridade dos meios permitiu detetar as três espécies de Vibrio e descartar falsos positivos, incluindo as colonias com menos de 1 mm em TCBS. Quanto a comparacao entre PCR realizado diretamente no segundo enriquecimento e o método oficial, apenas V. cholerae apresentou discrepância. Esta espécie foi detetada em CHROMagarTM, mas não foi detetada no enriquecimento. Isso demostra que nenhum método e ideal e que a realização de PCR diretamente em suspensões de enriquecimento não e, por si só, um método passível de substituir o método da ISO 21872-1: 2017. Por último, de forma a averiguar a viabilidade económica da realização das análises internamente, em detrimento da sua requisição a um laboratório de referencia, realizou-se a analise financeira do método. O custo da realização da análise no laboratório da A4F demostrou ser aproximadamente três vezes superior ao preço providenciado pelo laboratório externo. Como tal, não compensava financeiramente a implementação interna deste método. Como perspectivas futuras, e expetável o desenvolvimento e aprovação de novos métodos oficiais que poderão ser mais favoráveis economicamente. Paralelamente, considerando os recursos disponíveis, o segundo objetivo consistiu em utilizar sondas de hibridização fluorescente in situ (FISH), fornecidas pela Biomode SA, como método de deteção de V. vulnificus, V. parahaemolyticus e V. cholerae diretamente em amostras de cultura de microalgas. Durante a otimização do protocolo, um dos problemas enfrentados foi a autofluorescência da clorofila nas microalgas. Para solucionar este problema, o Negro Sudão B foi testado, com sucesso, como tratamento de redução da autofluorescência. De modo a inferir o limite de deteção do método, foi obtida a seguinte correlação entre UFC e Densidade Ótica (DO): UFC = (109) ・ (DO) + 7 ・ 108. Em seguida, as amostras de Nannochloropsis foram artificialmente contaminadas com diluições seriadas de concentrações conhecidas de V. parahaemolyticus. O limite de deteção obtido, 106 CFU mL-1, encontrou-se dentro do valor esperado em microscopia de fluorescência. Em todas as amostras testadas, vibrio nunca foi detetado em pastas de biomassa da A4F, possivelmente como consequência de Nannochloropsis apresentar capacidade de suprimir quantitativamente e qualitativamente o crescimento de algumas espécies de Vibrio. Deste modo, mesmo que vibrio estivesse presente, seria expetável que as UFC mL-1 permanecessem em valores reduzidos. Consequentemente, seria necessário uma etapa de enriquecimento, por exemplo em ASPW. Contudo, juntamente com o pré-requisito das etapas adicionais para inibição da autofluorescência das microalgas, o método demostrou ser demorado e com um limite de deteção acima dos valores esperados nas culturas. Portanto, a menos que vibrio se tornasse numa contaminação comum em culturas na A4F, não seria necessário a realização de análises de rotina. Adicionalmente, este método só poderia ser implementado como análise de rotina se as contaminações de vibrio apresentassem uma elevada carga bacteriana, considerando que teria de ser superior a 106 UFC mL-1 para ser detetado. Caso estas espécies de Vibrio fossem detetadas, as culturas seriam descartadas imediatamente, permitindo economizar futuros recursos em culturas que não poderiam ser comercializadas. Como perspetivas futuras, deveriam ser desenvolvidas sondas com diferentes fluorocromos, como por exemplo fluorescamina.