Publicação
Caracterização do perfil metabólico de células diferenciadas derivadas de células estaminais neurais da zona subventricular
| Resumo: | As células estaminais neurais (CENs) são células auto-renováveis e multipotentes, tendo deste modo a capacidade de proliferarem e de se diferenciarem em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. No cérebro adulto de mamíferos existem locais específicos onde as CENs se localizam, chamados, nichos neurogénicos. Estes nichos são, a zona subgranular no giro denteado do hipocampo e a zona subventricular (ZSV) na parede dos Ventrículos Laterais. A formação de novos neurónios (neurogénese) na fase adulta está bem estabelecida e caracterizada em modelos animais como em roedores. No entanto, embora a existência de neurogénese adulta em humanos já tenha sido demonstrada em diversos estudos, este tema ainda é alvo de grande debate na comunidade científica. A mitocôndria é um organelo que tem várias propriedades, tais como: bioenergética, responsável pela produção de ATP; dinâmica mitocondrial, que reflete os ciclos de fusão e fissão da mitocôndria; biogénese, que é a capacidade de formar novas mitocôndrias; e mitofagia, que mantém a qualidade mitocondrial por um processo de eliminação de mitocôndrias danificadas. Apesar da mitocôndria ser maioritariamente conhecida pelas suas capacidades energéticas, também é muito relevante na regulação de vias de sinalização celulares. Este organelo, tem vindo a revelar-se como fundamental para processos de regulação das CENs, tanto para a proliferação, como para a diferenciação. Vários estudos têm vindo a realçar a importância da mitocôndria para a regulação do processo de decisão da linhagem em que as CENs se vão comprometer. Mais concretamente, resultados previamente obtidos no laboratório mostraram que não só a morfologia mitocondrial é diferente após a diferenciação, como também varia entre linhagens, sugerindo uma adaptação mitocondrial dependente da linhagem celular. Deste modo, foi colocada a hipótese de que outras propriedades mitocondriais, tais como a bioenergética, poderiam alterar aquando da diferenciação e de forma especifica à linhagem. Embora ainda se desconheça o potencial papel da bioenergética na decisão da linhagem das CENs, estudos já reportaram que CENs são inicialmente mais dependentes da glicólise, e com a diferenciação em neurónios, as células ficam mais dependentes da fosforilação oxidativa. No entanto, os astrócitos e os oligodendrócitos não têm sido alvo de muito estudos, faltando informação relevante, particularmente alusiva a estes tipos celulares. Assim, o objetivo deste projeto foi caracterizar o perfil metabólico das diferentes células diferenciadas a partir das CENs da ZSV. Para atingir este objetivo, foram utilizadas culturas primárias de neuroesferas da ZSV de murganhos C57BL/6 ao dia pós-natal 1-3. Foram efetuadas duas passagens às neuroesferas, para aumentar o rendimento celular. Para promover a diferenciação das células das neuroesferas terciárias, estas foram dissociadas e plaqueadas num substrato e foi usado um meio com metade da concentração dos fatores de crescimento. Após 96h em meio com baixa concentração de fatores de crescimento, as células diferenciadas foram separadas através de Magnetic-Activated Cell Sorting, obtendo frações enriquecidas em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios separadamente. Vários controlos com as células não separadas foram considerados, tais como, um controlo de células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 24h, que foi o controlo da diferenciação; um controlo com células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 96h, que representa a mistura heterogénia de células quando estas já se encontram diferenciadas, e outro controlo nos mesmos tempos nos quais as células separadas foram analisadas (96h+3/4days). Todas as condições foram analisadas por imunocitoquímica e por testes respiratórios e de conteúdo de ATP. A imunocitoquímica foi utilizada para confirmar se cada condição continha os tipos celulares pretendidos. Por exemplo, foi usada para verificar se a separação magnética dos astrócitos, oligodendrócitos e neurónios correu como planeado, portanto se cada fração de células separadas contém a linhagem pretendida, sem contaminações significativas de outras linhagens. Nos testes respiratórios foi analisada a Taxa de Consumo de Oxigénio. Para tal foram adicionados vários moduladores da cadeia transportadora de eletrões: Oligomicína inibe o complexo V, impedindo a produção de ATP pela respiração mitocondrial; o FCCP é um desacoplador, que interrompe o gradiente de protões e permite que a cadeia transportadora de eletrões trabalhe na sua capacidade máxima; por fim a Rotenona e Antimicina A são inibidores dos complexos I e III, respetivamente. Esta experiência permitiu obter parâmetros, tais como, Respiração Basal, ATP ligado à Respiração Mitocondrial, Fuga de protões, Respiração Máxima, Capacidade Respiratória Sobresselente e Consumo de Oxigénio não Mitocondrial. O ensaio de conteúdo de ATP baseia-se num protocolo de luciferina, sendo que, a reação da luciferina com o ATP, catalisada pela luciferase, produz luz. Através da análise da luminescência é possível calcular a quantidade de ATP nas nossas amostras utilizando uma curva padrão com determinados valores de ATP. Relativamente aos resultados, começámos por caracterizar as culturas de neuroesferas, observando o seu tamanho e efetuando um estudo ao nível da proliferação das células. Neste estudo foram utilizados dois marcadores de proliferação diferentes: o BrdU que é um análogo da timidina que se incorpora no ADN durante a fase S da mitose; e o Ki-67 que é expresso durante o ciclo celular ativo (fases G1, S, G2 e M). Esta análise permitiu-nos concluir que embora o meio de baixa concentração de fatores de crescimento promova a diferenciação das CENs, este também tem a capacidade de favorecer a auto-renovação das mesmas. Observámos através de imunocitoquímica que as frações astróciticas, oligodendrociticas, e neuronais continham maioritariamente o tipo celular pretendido e sem contaminações significativas de outros tipos celulares. Através dos testes respiratórios observámos que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração Mitocondrial significativamente superior ao controlo das 96h. O que sugere que com a diferenciação e maturação das células, estas ficam mais dependentes da fosforilação oxidativa. Seria interessante observar futuramente se alterações metabólicas mais mínimas acontecem aquando da decisão de futuro das células, utilizando por exemplo, ensaios de atividade dos complexos da cadeia transportadora de eletrões. Também observámos que com a diferenciação astrocítica, a respiração basal das células aumenta e ocorre uma tendência para a redução da flexibilidade energética. Enquanto que com a diferenciação oligodendrocítica ocorre uma diminuição estatisticamente significativa da respiração máxima e da capacidade respiratória sobresselente. Embora os neurónios tenham a respiração basal inferior comparativamente às outras linhagens, estes também são a linhagem com maior capacidade respiratória sobresselente, o que reflete uma maior capacidade para responder em ambientes mais energeticamente exigentes. Estes dados estão de acordo com a função deste tipo celular, como a transmissão sináptica, que é extremamente exigente energeticamente. Relativamente ao conteúdo de ATP não foram observadas diferenças entre as diferentes linhagens. Sabendo que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração significativamente superior ao controlo das 96h, e observando que o nível de ATP é equivalente, isto sugere que ou as células às 96h+4days consomem mais ATP do que as das 96h, ou que as das 96h produzem mais ATP através de outras vias metabólicas que não a fosforilação oxidativa. Portanto, embora ainda muito trabalho se tenha de efetuar de forma a determinar mais concretamente o perfil bioenergético das diferentes linhagens das CENs da ZSV, estes resultados reforçam as diferenças metabólicas ao longo da diferenciação e entre as três linhagens. Deste modo, estes resultados apoiam a hipótese de que a bioenergética mitocondrial muda ao longo da diferenciação e de forma dependente da linhagem celular. Este projeto poderá ser importante para futuramente estudar se será possível modular a decisão de destino das CENs através da modulação das propriedades mitocondriais. Esta possível modulação poderá ter relevância ao nível de tratamento de doenças do sistema nervoso central, como por exemplo, promovendo a diferenciação de oligodendrócitos em pacientes com Esclerose Múltipla, uma doença caracterizada pela perda de oligodendrócitos. |
|---|---|
| Autores principais: | Mota, Isa Fernandes |
| Assunto: | Bioenergética Células estaminais neurais Diferenciação Mitocôndria Zona subventricular Teses de mestrado - 2022 |
| Ano: | 2023 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
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A mitocôndria é um organelo que tem várias propriedades, tais como: bioenergética, responsável pela produção de ATP; dinâmica mitocondrial, que reflete os ciclos de fusão e fissão da mitocôndria; biogénese, que é a capacidade de formar novas mitocôndrias; e mitofagia, que mantém a qualidade mitocondrial por um processo de eliminação de mitocôndrias danificadas. Apesar da mitocôndria ser maioritariamente conhecida pelas suas capacidades energéticas, também é muito relevante na regulação de vias de sinalização celulares. Este organelo, tem vindo a revelar-se como fundamental para processos de regulação das CENs, tanto para a proliferação, como para a diferenciação. Vários estudos têm vindo a realçar a importância da mitocôndria para a regulação do processo de decisão da linhagem em que as CENs se vão comprometer. Mais concretamente, resultados previamente obtidos no laboratório mostraram que não só a morfologia mitocondrial é diferente após a diferenciação, como também varia entre linhagens, sugerindo uma adaptação mitocondrial dependente da linhagem celular. Deste modo, foi colocada a hipótese de que outras propriedades mitocondriais, tais como a bioenergética, poderiam alterar aquando da diferenciação e de forma especifica à linhagem. Embora ainda se desconheça o potencial papel da bioenergética na decisão da linhagem das CENs, estudos já reportaram que CENs são inicialmente mais dependentes da glicólise, e com a diferenciação em neurónios, as células ficam mais dependentes da fosforilação oxidativa. No entanto, os astrócitos e os oligodendrócitos não têm sido alvo de muito estudos, faltando informação relevante, particularmente alusiva a estes tipos celulares. Assim, o objetivo deste projeto foi caracterizar o perfil metabólico das diferentes células diferenciadas a partir das CENs da ZSV. Para atingir este objetivo, foram utilizadas culturas primárias de neuroesferas da ZSV de murganhos C57BL/6 ao dia pós-natal 1-3. Foram efetuadas duas passagens às neuroesferas, para aumentar o rendimento celular. Para promover a diferenciação das células das neuroesferas terciárias, estas foram dissociadas e plaqueadas num substrato e foi usado um meio com metade da concentração dos fatores de crescimento. Após 96h em meio com baixa concentração de fatores de crescimento, as células diferenciadas foram separadas através de Magnetic-Activated Cell Sorting, obtendo frações enriquecidas em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios separadamente. Vários controlos com as células não separadas foram considerados, tais como, um controlo de células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 24h, que foi o controlo da diferenciação; um controlo com células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 96h, que representa a mistura heterogénia de células quando estas já se encontram diferenciadas, e outro controlo nos mesmos tempos nos quais as células separadas foram analisadas (96h+3/4days). Todas as condições foram analisadas por imunocitoquímica e por testes respiratórios e de conteúdo de ATP. A imunocitoquímica foi utilizada para confirmar se cada condição continha os tipos celulares pretendidos. Por exemplo, foi usada para verificar se a separação magnética dos astrócitos, oligodendrócitos e neurónios correu como planeado, portanto se cada fração de células separadas contém a linhagem pretendida, sem contaminações significativas de outras linhagens. Nos testes respiratórios foi analisada a Taxa de Consumo de Oxigénio. Para tal foram adicionados vários moduladores da cadeia transportadora de eletrões: Oligomicína inibe o complexo V, impedindo a produção de ATP pela respiração mitocondrial; o FCCP é um desacoplador, que interrompe o gradiente de protões e permite que a cadeia transportadora de eletrões trabalhe na sua capacidade máxima; por fim a Rotenona e Antimicina A são inibidores dos complexos I e III, respetivamente. Esta experiência permitiu obter parâmetros, tais como, Respiração Basal, ATP ligado à Respiração Mitocondrial, Fuga de protões, Respiração Máxima, Capacidade Respiratória Sobresselente e Consumo de Oxigénio não Mitocondrial. O ensaio de conteúdo de ATP baseia-se num protocolo de luciferina, sendo que, a reação da luciferina com o ATP, catalisada pela luciferase, produz luz. Através da análise da luminescência é possível calcular a quantidade de ATP nas nossas amostras utilizando uma curva padrão com determinados valores de ATP. Relativamente aos resultados, começámos por caracterizar as culturas de neuroesferas, observando o seu tamanho e efetuando um estudo ao nível da proliferação das células. Neste estudo foram utilizados dois marcadores de proliferação diferentes: o BrdU que é um análogo da timidina que se incorpora no ADN durante a fase S da mitose; e o Ki-67 que é expresso durante o ciclo celular ativo (fases G1, S, G2 e M). Esta análise permitiu-nos concluir que embora o meio de baixa concentração de fatores de crescimento promova a diferenciação das CENs, este também tem a capacidade de favorecer a auto-renovação das mesmas. Observámos através de imunocitoquímica que as frações astróciticas, oligodendrociticas, e neuronais continham maioritariamente o tipo celular pretendido e sem contaminações significativas de outros tipos celulares. Através dos testes respiratórios observámos que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração Mitocondrial significativamente superior ao controlo das 96h. O que sugere que com a diferenciação e maturação das células, estas ficam mais dependentes da fosforilação oxidativa. Seria interessante observar futuramente se alterações metabólicas mais mínimas acontecem aquando da decisão de futuro das células, utilizando por exemplo, ensaios de atividade dos complexos da cadeia transportadora de eletrões. Também observámos que com a diferenciação astrocítica, a respiração basal das células aumenta e ocorre uma tendência para a redução da flexibilidade energética. Enquanto que com a diferenciação oligodendrocítica ocorre uma diminuição estatisticamente significativa da respiração máxima e da capacidade respiratória sobresselente. Embora os neurónios tenham a respiração basal inferior comparativamente às outras linhagens, estes também são a linhagem com maior capacidade respiratória sobresselente, o que reflete uma maior capacidade para responder em ambientes mais energeticamente exigentes. Estes dados estão de acordo com a função deste tipo celular, como a transmissão sináptica, que é extremamente exigente energeticamente. Relativamente ao conteúdo de ATP não foram observadas diferenças entre as diferentes linhagens. Sabendo que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração significativamente superior ao controlo das 96h, e observando que o nível de ATP é equivalente, isto sugere que ou as células às 96h+4days consomem mais ATP do que as das 96h, ou que as das 96h produzem mais ATP através de outras vias metabólicas que não a fosforilação oxidativa. Portanto, embora ainda muito trabalho se tenha de efetuar de forma a determinar mais concretamente o perfil bioenergético das diferentes linhagens das CENs da ZSV, estes resultados reforçam as diferenças metabólicas ao longo da diferenciação e entre as três linhagens. Deste modo, estes resultados apoiam a hipótese de que a bioenergética mitocondrial muda ao longo da diferenciação e de forma dependente da linhagem celular. Este projeto poderá ser importante para futuramente estudar se será possível modular a decisão de destino das CENs através da modulação das propriedades mitocondriais. Esta possível modulação poderá ter relevância ao nível de tratamento de doenças do sistema nervoso central, como por exemplo, promovendo a diferenciação de oligodendrócitos em pacientes com Esclerose Múltipla, uma doença caracterizada pela perda de oligodendrócitos. |
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A mitocôndria é um organelo que tem várias propriedades, tais como: bioenergética, responsável pela produção de ATP; dinâmica mitocondrial, que reflete os ciclos de fusão e fissão da mitocôndria; biogénese, que é a capacidade de formar novas mitocôndrias; e mitofagia, que mantém a qualidade mitocondrial por um processo de eliminação de mitocôndrias danificadas. Apesar da mitocôndria ser maioritariamente conhecida pelas suas capacidades energéticas, também é muito relevante na regulação de vias de sinalização celulares. Este organelo, tem vindo a revelar-se como fundamental para processos de regulação das CENs, tanto para a proliferação, como para a diferenciação. Vários estudos têm vindo a realçar a importância da mitocôndria para a regulação do processo de decisão da linhagem em que as CENs se vão comprometer. 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Para atingir este objetivo, foram utilizadas culturas primárias de neuroesferas da ZSV de murganhos C57BL/6 ao dia pós-natal 1-3. Foram efetuadas duas passagens às neuroesferas, para aumentar o rendimento celular. Para promover a diferenciação das células das neuroesferas terciárias, estas foram dissociadas e plaqueadas num substrato e foi usado um meio com metade da concentração dos fatores de crescimento. Após 96h em meio com baixa concentração de fatores de crescimento, as células diferenciadas foram separadas através de Magnetic-Activated Cell Sorting, obtendo frações enriquecidas em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios separadamente. Vários controlos com as células não separadas foram considerados, tais como, um controlo de células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 24h, que foi o controlo da diferenciação; um controlo com células em meio de baixa concentração de fatores de crescimento durante 96h, que representa a mistura heterogénia de células quando estas já se encontram diferenciadas, e outro controlo nos mesmos tempos nos quais as células separadas foram analisadas (96h+3/4days). Todas as condições foram analisadas por imunocitoquímica e por testes respiratórios e de conteúdo de ATP. A imunocitoquímica foi utilizada para confirmar se cada condição continha os tipos celulares pretendidos. Por exemplo, foi usada para verificar se a separação magnética dos astrócitos, oligodendrócitos e neurónios correu como planeado, portanto se cada fração de células separadas contém a linhagem pretendida, sem contaminações significativas de outras linhagens. Nos testes respiratórios foi analisada a Taxa de Consumo de Oxigénio. Para tal foram adicionados vários moduladores da cadeia transportadora de eletrões: Oligomicína inibe o complexo V, impedindo a produção de ATP pela respiração mitocondrial; o FCCP é um desacoplador, que interrompe o gradiente de protões e permite que a cadeia transportadora de eletrões trabalhe na sua capacidade máxima; por fim a Rotenona e Antimicina A são inibidores dos complexos I e III, respetivamente. Esta experiência permitiu obter parâmetros, tais como, Respiração Basal, ATP ligado à Respiração Mitocondrial, Fuga de protões, Respiração Máxima, Capacidade Respiratória Sobresselente e Consumo de Oxigénio não Mitocondrial. O ensaio de conteúdo de ATP baseia-se num protocolo de luciferina, sendo que, a reação da luciferina com o ATP, catalisada pela luciferase, produz luz. 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Através dos testes respiratórios observámos que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração Mitocondrial significativamente superior ao controlo das 96h. O que sugere que com a diferenciação e maturação das células, estas ficam mais dependentes da fosforilação oxidativa. Seria interessante observar futuramente se alterações metabólicas mais mínimas acontecem aquando da decisão de futuro das células, utilizando por exemplo, ensaios de atividade dos complexos da cadeia transportadora de eletrões. Também observámos que com a diferenciação astrocítica, a respiração basal das células aumenta e ocorre uma tendência para a redução da flexibilidade energética. Enquanto que com a diferenciação oligodendrocítica ocorre uma diminuição estatisticamente significativa da respiração máxima e da capacidade respiratória sobresselente. Embora os neurónios tenham a respiração basal inferior comparativamente às outras linhagens, estes também são a linhagem com maior capacidade respiratória sobresselente, o que reflete uma maior capacidade para responder em ambientes mais energeticamente exigentes. Estes dados estão de acordo com a função deste tipo celular, como a transmissão sináptica, que é extremamente exigente energeticamente. Relativamente ao conteúdo de ATP não foram observadas diferenças entre as diferentes linhagens. Sabendo que o controlo das 96h+4days tem uma produção de ATP ligado à Respiração significativamente superior ao controlo das 96h, e observando que o nível de ATP é equivalente, isto sugere que ou as células às 96h+4days consomem mais ATP do que as das 96h, ou que as das 96h produzem mais ATP através de outras vias metabólicas que não a fosforilação oxidativa. Portanto, embora ainda muito trabalho se tenha de efetuar de forma a determinar mais concretamente o perfil bioenergético das diferentes linhagens das CENs da ZSV, estes resultados reforçam as diferenças metabólicas ao longo da diferenciação e entre as três linhagens. Deste modo, estes resultados apoiam a hipótese de que a bioenergética mitocondrial muda ao longo da diferenciação e de forma dependente da linhagem celular. Este projeto poderá ser importante para futuramente estudar se será possível modular a decisão de destino das CENs através da modulação das propriedades mitocondriais. 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| topic_facet | Bioenergética Células estaminais neurais Diferenciação Mitocôndria Zona subventricular Teses de mestrado - 2022 |
| url | http://hdl.handle.net/10451/61320 |
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