Publicação

Estudo do controlo da expressão génica da eritropoietina humana por uma pequena grelha de leitura a montante da grelha principal

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Vários elementos do mRNA, que actuam em cis, participam na regulação da síntese proteica, incluindo codões AUGs na região líder do transcrito, ou, em alguns casos, grelhas de leitura a estes associadas (upstream open reading frames uORFs). Embora aproximadamente 15% dos mRNAs humanos (principalmente, transcritos codificantes de factores de crescimento ou hormonas) contenham uORFs, na maioria dos casos, o princípio pelo qual a uORF medeia o controlo traducional é pouco compreendido. A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína sintetizada e excretada principalmente pelo rim, cuja função hormonal clássica envolve um papel chave na eritropoiese. No entanto, diversas funções não-hematopoiéticas foram recentemente descritas. Consequentemente, a EPO pode ser utilizada como alvo terapêutico para diversas disfunções humanas. A compreensão dos mecanismos moleculares do controlo traducional do mRNA da EPO pode ser útil na determinação dessas terapias. Sabendo que o transcrito da EPO humana apresenta uma região 5' líder com 181 nucleótidos contendo uma uORF de 14 codões e dado que parece ser conservada entre espécies diferentes, o que parece indicar a sua função na regulação traducional, o objectivo foi investigar esta hipótese. De forma a analisar o efeito desta uORF, as linhas celulares HepG2 e HEK293 foram transfectadas com diversas construções usando o gene repórter da luciferase com a uORF intacta ou inactiva. A actividade da luciferase foi medida por ensaios de luminescência e normalizada aos correspondentes níveis de mRNA para obter as eficiências traducionais. Os níveis de mRNA foram quantificados por RT-PCR quantitativo. Os resultados revelaram que a uORF consegue diminuir a eficiência traducional da ORF principal em cerca de 70%. Adicionalmente, os resultados sustentam a conclusão de que o leaky scanning reconhece o codão AUG principal. Para além disso, a uORF é capaz de responder à falta de nutrientes aumentando a quantidade de proteína produzida, de uma forma específica de tecido.
Autores principais:	Barbosa, Cristina Maria Botelho da Rocha
Assunto:	Biologia molecular Expressão genética Eritropoetina Teses de mestrado
Ano:	2009
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Vários elementos do mRNA, que actuam em cis, participam na regulação da síntese proteica, incluindo codões AUGs na região líder do transcrito, ou, em alguns casos, grelhas de leitura a estes associadas (upstream open reading frames uORFs). Embora aproximadamente 15% dos mRNAs humanos (principalmente, transcritos codificantes de factores de crescimento ou hormonas) contenham uORFs, na maioria dos casos, o princípio pelo qual a uORF medeia o controlo traducional é pouco compreendido. A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína sintetizada e excretada principalmente pelo rim, cuja função hormonal clássica envolve um papel chave na eritropoiese. No entanto, diversas funções não-hematopoiéticas foram recentemente descritas. Consequentemente, a EPO pode ser utilizada como alvo terapêutico para diversas disfunções humanas. A compreensão dos mecanismos moleculares do controlo traducional do mRNA da EPO pode ser útil na determinação dessas terapias. Sabendo que o transcrito da EPO humana apresenta uma região 5' líder com 181 nucleótidos contendo uma uORF de 14 codões e dado que parece ser conservada entre espécies diferentes, o que parece indicar a sua função na regulação traducional, o objectivo foi investigar esta hipótese. De forma a analisar o efeito desta uORF, as linhas celulares HepG2 e HEK293 foram transfectadas com diversas construções usando o gene repórter da luciferase com a uORF intacta ou inactiva. A actividade da luciferase foi medida por ensaios de luminescência e normalizada aos correspondentes níveis de mRNA para obter as eficiências traducionais. Os níveis de mRNA foram quantificados por RT-PCR quantitativo. Os resultados revelaram que a uORF consegue diminuir a eficiência traducional da ORF principal em cerca de 70%. Adicionalmente, os resultados sustentam a conclusão de que o leaky scanning reconhece o codão AUG principal. Para além disso, a uORF é capaz de responder à falta de nutrientes aumentando a quantidade de proteína produzida, de uma forma específica de tecido.