Publicação

Trimeric autotransporter adhesins (TAAs) from Photobacterium damselae subsp. piscicida: investigation of biological functions and recombinant production to use as antigens

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As bactérias patogénicas são capazes de aderir e invadir células e tecidos do hospedeiro, através da produção de macromoléculas denominadas adesinas. A fotobacteriose é uma septicemia que ameaça a produção de peixes marinhos, causada pela bactéria gram-negativa Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp). Embora tenham sido descritos diversos mecanismos de virulência da Phdp, a sua patogenicidade não está completamente elucidada. Estudos realizados numa estirpe hipervirulenta de Phdp (HV#10) levaram à descoberta de duas proteínas, PadA e PadB, que não estão presentes na estirpe virulenta MT1415. Previsões in silico sugerem que se trata de adesinas triméricas autotransportadas (TAAs). Com base no que se conhece sobre a função de TAAs em diversas bactérias, prevê-se que a PadA e PadB possam desempenhar um papel importante na virulência de Phdp. Com base nesta premissa, foram desenvolvidas ferramentas que permitam estudar a função biológica destas proteínas, assim como testar o seu potencial como componentes de vacinas contra a fotobacteriose. Os genes codificantes da PadA e PadB encontram-se localizados num plasmídeo instável que é rapidamente perdido durante o crescimento in vitro, o que dificulta a obtenção de mutantes da PadA e PadB. Assim sendo, optou-se por uma estratégia alternativa, baseada no uso da estirpe MT1415, que não contém estas proteínas. Utilizando técnicas de biologia molecular, as sequências codificantes da PadA e PadB foram clonadas num vetor mobilizável, e as construções obtidas foram introduzidos na estirpe MT1415 por conjugação, o que permitiu obter clones MT1415 a expressar PadA e PadB. Estes clones foram usados em testes biológicos para avaliar agregação bacteriana e formação de biofilme. Os resultados obtidos, embora preliminares, sugerem que a expressão da PadA e PadB não promove a agregação bacteriana nem a formação de biofilmes. No entanto, a análise microscópica das culturas bacterianas em crescimento estático revelou diferenças na distribuição/associação das células. Estas observações são promissoras e sugerem que com um melhoramento e otimização dos protocolos poderá ser possível detetar diferenças na adesão das bactérias a superfícies. Com o intuito de produzir versões recombinantes da PadA e PadB para posterior uso no desenvolvimento experimental de vacinas anti-Phdp, foram clonadas as sequências codificantes de versões completas e truncadas das proteínas num vetor de expressão em E. coli e foram realizados testes de expressão em pequena escala, para determinar a melhor condição para expressão de cada proteína. De seguida, foi realizada expressão em larga escala e purificação de versões selecionadas de PadA e PadB, o que permitiu obter proteínas puras e em quantidade suficiente para a produção de anticorpos. Em conclusão, este trabalho permitiu gerar ferramentas importantes para o estudo da função biológica das PadA e PadB de Phdp, assim como para explorar o seu potencial biotecnológico. Isto é um passo importante não só para o entendimento dos mecanismos subjacentes às infecções por Phdp, mas também para o desenvolvimento de novas e mais eficientes medidas profiláticas contra a fotobacteriose. Além disso, num contexto mais amplo, o estudo destas proteínas pode contribuir para compreender as funções de outras TAA de bactérias patogénicas para o Homem e outros animais.
Autores principais:	Afonso, Gabriela Alves
Assunto:	Fotobacteriose TAAs
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da UTAD