O método de extração de DNA influencia a taxa de recuperação dos controlos exógenos usados para a normalização do qPCR

• Author(s): Lima, Ângela Martins ; França, Ângela Maria Oliveira Sousa ; Sousa, Lúcia Filipa Guimarães Vieira ; Macedo, Filipa ; Cerca, Nuno
• Date: 2022
• Persistent ID: https://hdl.handle.net/1822/95685
• Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Document Type: Other
• Language: Portuguese
• Contributor(s): Universidade do Minho

Description

Background. O PCR quantitativo, método baseado no princípio da reação em cadeia da polimerase, é um procedimento bem estabelecido e extensivamente usado para a quantificação bacteriana, sobretudo devido à sua sensibilidade, acessibilidade, facilidade de utilização e robustez. Foram por isso estabelecidas diretrizes, há mais de 10 anos, com o propósito de orientar os investigadores a utilizar esta metodologia de forma correta e, assim, obter dados reprodutíveis e representativos. Contudo, existe um número significativo de publicações recentes que não consideram aspetos essenciais para a correta quantificação bacteriana, sendo um deles o uso de controlos exógenos para normalizar as perdas de gDNA durante o processo de extração. Objetivos. Neste trabalho pretendeu-se assim demonstrar a importância da utilização de controlos exógenos para a normalização de resultados de extração de DNA para quantificação bacteriana. Para isso, usaram-se dois métodos de extração de DNA diferentes, designadamente a extração por colunas de sílica ou extração química por fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Pretendeu-se ainda determinar o efeito do tamanho da molécula de controlo exógeno na eficiência da extração de DNA. Métodos. Prepararam-se culturas bacterianas com diferentes concentrações (de 1×107 a 3×108 células/mL) tendo sido efetuadas múltiplas extrações usando cada um dos 2 métodos selecionados. Foram adicionadas 3 moléculas de DNA exógenas, nomeadamente, o gDNA de Staphylococcus epidermidis, um plasmídeo (piMAY) e o cDNA da luciferase. A quantificação da bactéria alvo foi depois normalizada aos 3 controlos exógenos testados. Resultados. Demonstrou-se que o tamanho e a conformação dos controlos exógenos tiveram pouco efeito na taxa de recuperação dos mesmos quando usamos o método de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. No entanto, para as colunas de sílica, verificou-se uma elevada variação tendo em conta o controlo exógeno utilizado. Curiosamente, verificou-se que a taxa de recuperação dos controlos exógenos não refletiu a quantidade de bactéria que se conseguiu quantificar. Conclusões: Os resultados aqui apresentados revelam as limitações metodológicas existentes na maioria dos artigos que utilizam qPCR para quantificar bactérias. Apresentaremos, no entanto, uma solução para mitigar estes problemas, baseados numa extensiva pesquisa bibliográfica focada em artigos que recentemente utilizaram este método para quantificar amostras bacterianas.