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POTENCIAL TERAPÊUTICO DE INIBIDORES DO NRF2 NA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA EM ASSOCIAÇÃO COM O IBRUTINIB ESTUDOS IN VITRO

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A leucemia linfocítica crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais comum nos países ocidentais, sendo mais prevalente em homens. Várias alterações genéticas podem ser encontradas nesta patologia, desde alterações cromossómicas, alterações na expressão de miRNAs, mutações somáticas e modificações epigenéticas. O stresse oxidativo, que resulta do desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio (ROS/RNS) e as defesas antioxidantes, em favor das primeiras, parece também desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento desta doença. A via NRF2-KEAP1 é o principal mecanismo de resposta antioxidante e citoprotetora contra as ROS. Esta via de sinalização celular apresenta um duplo papel no cancro – por um lado previne o desenvolvimento tumoral e por outro, após o estabelecimento da neoplasia, pode proteger as células tumorais dos agentes terapêuticos conduzindo a resistência ao tratamento. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico de dois inibidores do NRF2, o brusatol e o ML385, em monoterapia e em associação com o ibrutinib (um inibidor da tirosina cinase de Bruton), num modelo in vitro de LLC, a linha celular HG-3.Em primeiro lugar, os níveis de expressão dos genes NFE2L2 (codifica o NRF2) e KEAP1 (codifica o KEAP1) foram avaliados por qPCR, na linha celular HG-3. Seguidamente, as células HG-3 foram incubadas, durante 72 horas, na ausência e na presença de concentrações crescentes de brusatol, ML385 e ibrutinib, em monoterapia e em combinação. A atividade metabólica foi avaliada através do ensaio da resazurina. Uma vez que o brusatol demonstrou maior potencial terapêutico na LLC, em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a estes esquemas terapêuticos. Para avaliar o tipo de morte celular utilizou-se a técnica de citometria de fluxo (CF), através da dupla marcação Anexina V e 7-amino-actinomicina D (7-AAD) e por análise morfológica através da coloração de May-Grünwald Giemsa. O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo através da utilização da solução iodeto de propídio (PI)/RNAse. De modo a avaliar o potencial da membrana mitocondrial recorreu-se à citometria de fluxo, em que se utilizou a sonda JC-1. Os níveis intracelulares de peróxidos, ROS com origem mitocondrial, anião superóxido, óxido nítrico e glutationa reduzida foram analisados por citometria de fluxo com recurso às sondas fluorescentes, DCFH2-DA, DHR-123, DHE, DAF-FM DA e MO, respetivamente. Por fim foram avaliados os níveis de expressão dos genes KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1, que são regulados pela proteína NRF2, pela técnica de qPCR. Os resultados foram analisados tendo em consideração um nível de significância de 95% (p<0,05).Os resultados demonstraram que as células HG-3 expressavam ambos os genes que codificam as proteínas KEAP1 e NRF2. O brusatol e o ML385 reduziram a atividade metabólica das células HG-3 de forma dependente da dose e do tempo. No entanto esta linha celular revelou ser mais sensível ao brusatol, sendo o valor do IC50 às 48 horas de incubação, aproximadamente, 110 nM para o brusatol e de 500 µM para o ML385. A combinação do brusatol (50 nM) com o ibrutinib (0,5 µM) revelou ser bastante eficaz, sendo a redução dos níveis da atividade metabólica maior que a soma dos efeitos individuais dos fármacos (efeito sinérgico), às 48 e 72 horas de incubação (37% e 37% para a combinação, 67% e 57%, para o brusatol em monoterapia e 79% e 74% para o ibrutinib em monoterapia, respetivamente). Por outro lado, a combinação entre o ML385 (2,5 µM) e ibrutinib (0,5 µM) não demonstrou ser tão eficaz sendo a redução da atividade metabólica das células HG-3 inferior à soma dos efeitos individuais dos fármacos em todos os tempos de incubação.O brusatol em monoterapia e em combinação terapêutica com ibrutinib induziu efeito citotóxico e citostático. A morte celular foi mediada, sobretudo, por apoptose e observou-se um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Além disso, o brusatol, em monoterapia e em associação com o ibrutinib, diminuiu o potencial da membrana mitocondrial em comparação com o controlo, confirmando que estas estratégias terapêuticas induzem morte por apoptose. Pela análise de espécies reativas de oxigénio (peróxidos intracelulares, anião superóxido e ROS com origem mitocondrial), de nitrogénio (óxido nítrico) e da glutationa reduzida determinou-se que o brusatol em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, induziram aumento das ROS/RNS e diminuição da GSH. Este resultado foi confirmado pelo aumento da razão ROS/GSH. No entanto, o tratamento com brusatol não parece influenciar a expressão dos genes envolvidos na via de sinalização do NRF2 (KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1).Em conclusão, este estudo permitiu elucidar que o brusatol poderá ser um potencial agente farmacológico para a terapêutica da LLC, em monoterapia e como coadjuvante do tratamento com ibrutinib.
Autores principais:	Constantino, Beatriz Heliodoro
Assunto:	Leucemia linfocítica crónica Stresse oxidativo Via NRF2-KEAP1 Inibidores do NRF2 Ibrutinib Chronic lymphocytic leukemia Oxidative stress NRF2-KEAP1 pathway NRF2 inhibitors Ibrutinib
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Coimbra
Idioma:	português
Origem:	Estudo Geral - Universidade de Coimbra

Descrição
Resumo:	A leucemia linfocítica crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais comum nos países ocidentais, sendo mais prevalente em homens. Várias alterações genéticas podem ser encontradas nesta patologia, desde alterações cromossómicas, alterações na expressão de miRNAs, mutações somáticas e modificações epigenéticas. O stresse oxidativo, que resulta do desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio (ROS/RNS) e as defesas antioxidantes, em favor das primeiras, parece também desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento desta doença. A via NRF2-KEAP1 é o principal mecanismo de resposta antioxidante e citoprotetora contra as ROS. Esta via de sinalização celular apresenta um duplo papel no cancro – por um lado previne o desenvolvimento tumoral e por outro, após o estabelecimento da neoplasia, pode proteger as células tumorais dos agentes terapêuticos conduzindo a resistência ao tratamento. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico de dois inibidores do NRF2, o brusatol e o ML385, em monoterapia e em associação com o ibrutinib (um inibidor da tirosina cinase de Bruton), num modelo in vitro de LLC, a linha celular HG-3.Em primeiro lugar, os níveis de expressão dos genes NFE2L2 (codifica o NRF2) e KEAP1 (codifica o KEAP1) foram avaliados por qPCR, na linha celular HG-3. Seguidamente, as células HG-3 foram incubadas, durante 72 horas, na ausência e na presença de concentrações crescentes de brusatol, ML385 e ibrutinib, em monoterapia e em combinação. A atividade metabólica foi avaliada através do ensaio da resazurina. Uma vez que o brusatol demonstrou maior potencial terapêutico na LLC, em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a estes esquemas terapêuticos. Para avaliar o tipo de morte celular utilizou-se a técnica de citometria de fluxo (CF), através da dupla marcação Anexina V e 7-amino-actinomicina D (7-AAD) e por análise morfológica através da coloração de May-Grünwald Giemsa. O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo através da utilização da solução iodeto de propídio (PI)/RNAse. De modo a avaliar o potencial da membrana mitocondrial recorreu-se à citometria de fluxo, em que se utilizou a sonda JC-1. Os níveis intracelulares de peróxidos, ROS com origem mitocondrial, anião superóxido, óxido nítrico e glutationa reduzida foram analisados por citometria de fluxo com recurso às sondas fluorescentes, DCFH2-DA, DHR-123, DHE, DAF-FM DA e MO, respetivamente. Por fim foram avaliados os níveis de expressão dos genes KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1, que são regulados pela proteína NRF2, pela técnica de qPCR. Os resultados foram analisados tendo em consideração um nível de significância de 95% (p<0,05).Os resultados demonstraram que as células HG-3 expressavam ambos os genes que codificam as proteínas KEAP1 e NRF2. O brusatol e o ML385 reduziram a atividade metabólica das células HG-3 de forma dependente da dose e do tempo. No entanto esta linha celular revelou ser mais sensível ao brusatol, sendo o valor do IC50 às 48 horas de incubação, aproximadamente, 110 nM para o brusatol e de 500 µM para o ML385. A combinação do brusatol (50 nM) com o ibrutinib (0,5 µM) revelou ser bastante eficaz, sendo a redução dos níveis da atividade metabólica maior que a soma dos efeitos individuais dos fármacos (efeito sinérgico), às 48 e 72 horas de incubação (37% e 37% para a combinação, 67% e 57%, para o brusatol em monoterapia e 79% e 74% para o ibrutinib em monoterapia, respetivamente). Por outro lado, a combinação entre o ML385 (2,5 µM) e ibrutinib (0,5 µM) não demonstrou ser tão eficaz sendo a redução da atividade metabólica das células HG-3 inferior à soma dos efeitos individuais dos fármacos em todos os tempos de incubação.O brusatol em monoterapia e em combinação terapêutica com ibrutinib induziu efeito citotóxico e citostático. A morte celular foi mediada, sobretudo, por apoptose e observou-se um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Além disso, o brusatol, em monoterapia e em associação com o ibrutinib, diminuiu o potencial da membrana mitocondrial em comparação com o controlo, confirmando que estas estratégias terapêuticas induzem morte por apoptose. Pela análise de espécies reativas de oxigénio (peróxidos intracelulares, anião superóxido e ROS com origem mitocondrial), de nitrogénio (óxido nítrico) e da glutationa reduzida determinou-se que o brusatol em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, induziram aumento das ROS/RNS e diminuição da GSH. Este resultado foi confirmado pelo aumento da razão ROS/GSH. No entanto, o tratamento com brusatol não parece influenciar a expressão dos genes envolvidos na via de sinalização do NRF2 (KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1).Em conclusão, este estudo permitiu elucidar que o brusatol poderá ser um potencial agente farmacológico para a terapêutica da LLC, em monoterapia e como coadjuvante do tratamento com ibrutinib.