Publicação

Mitochondria-based screening of drug neurotoxicity in differentiated SH-SY5Y cells

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Drogas de abuso afetam a mitocôndria e a sua toxicidade mitocondrial pode ser responsável pelos processos de neurodegeneração. Compreender os mecanismos responsáveis pela toxicidade mitocondrial pode possibilitar o desenvolvimento de estratégias para impedir a neurodegeneração e permitir a previsão do potencial tóxico de novos compostos. Neste trabalho, o nosso objetivo foi identificar marcadores que precedem a neurotoxicidade caracterizada pela perda de viabilidade celular e perceber como é que a mitocôndria intervém na toxicidade celular induzida por drogas de abuso. A primeira tarefa baseou-se na caracterização da ordem cronológica de eventos que precedem a morte celular neuronal desencadeada por drogas de abuso clássicas pertencentes a diferentes classes, incluindo Cocaína, metanfetamina (METH) e Metadona. A segunda tarefa envolveu a aplicação do conhecimento obtido com as drogas clássicas para caracterizar a neurotoxicidade de Mescalina (MESC) e de drogas de desenho como 2,5-dimetoxi-4-bromo-anfetamina (DOB) e 3,4-Metilenodioxianfetamina (MDA).Células SH-SY5Y foram diferenciadas de modo a obter-se um fenótipo neuronal. As células foram expostas a diferentes concentrações das drogas clássicas e os seus efeitos foram analisados após diferentes tempos de exposição, medindo o conteúdo de espécies reativas de oxigénio (ERO) (0-12h), viabilidade celular (ATP (24h), atividade metabólica e massa celular (24-72h)), ativação das caspases 3 e 7 (24h) e perda da integridade da membrana celular (usando Hoechst 33342/Iodeto de Propídeo) (72 e 96h). A polarização mitocondrial e a extensão da rede mitocondrial polarizada foram analisadas usando MitoTracker™ Red CMXRos (24h). O número de cópias do DNA mitocondrial também foi determinado. A significância estatística foi estabelecida para valores de P<0,05. Durante a primeira hora de incubação não houve alterações significativas no conteúdo de EROs no caso da Cocaína e METH; no entanto, para Metadona (0,0391mM) foi observada uma diminuição clara. Após 6h de incubação com 5,00mM de Cocaína, os níveis de EROs parecem ter atingido um plateau. Para o mesmo período, as concentrações de 2,50 e 5,00mM de Cocaína provocaram um aumento significativo no conteúdo de EROs. A exposição a METH e Metadona durante 12h pareceu aumentar ligeiramente os níveis de EROs, mas, curiosamente, não para as concentrações mais altas.Após 24h de exposição, a polarização mitocondrial foi distintamente afetada pelas diferentes drogas de abuso, tendo diminuído para as concentrações mais altas de Cocaína (2,50 e 10,0mM) e aumentado para as concentrações mais altas de METH (0,313 a 2,50mM). A polarização mitocondrial aumentou significativamente para concentrações mais baixas de Metadona (0,0391 e 0,0781mM) e diminuiu ligeiramente para concentrações mais altas (0,156 e 0,313mM). A extensão da rede mitocondrial polarizada diminuiu significativamente para as concentrações mais elevadas de todos os compostos testados (5,00 e 10,0mM de Cocaína, 2,50mM de METH, 0,156 e 0,0313mM de Metadona). Além disso, após 24h, observou-se uma ativação das caspases 3/7 para as concentrações de 2,50 mM de Cocaína, 1,25mM METH e 0,156mM de Metadona. As drogas de abuso (às concentrações testadas) não induziram alterações significativas no número de cópias do mtDNA.Todas as drogas de abuso induziram uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular às 24, 48 e 72h de exposição, em comparação com o controlo. O cálculo dos IC50s, com 24, 48 e 72h de exposição, mostrou que a Metadona apresentou o perfil mais tóxico, seguida pela METH e, por fim, a Cocaína. As drogas de abuso testadas também induziram perda da integridade membranar celular em concentrações mais altas (5.00mM de Cocaína, 1.25 e 2.50mM METH e 0.0781 e 0.156mM Metadona) após 72h, e também para as concentrações de 2.50mM METH e 0.156, 0.313mM Metadona, após 96h.De seguida, avaliou-se a viabilidade celular após exposição a DOB, MDA e MESC de forma a compreender se os mecanismos subjacentes à toxicidade dos derivados são comparáveis aos observados para as drogas clássicas. Resultados preliminares indicaram que DOB foi o composto mais tóxico, e que MDA e MESC parecem induzir efeitos semelhantes. A DOB, à concentração de 0.200mM, também aumentou significativamente a ativação das caspases 3/7, após 24h.Já que DOB e MDA, são derivados da estrutura da anfetamina e similares à MESC, os dados podem contribuir para o estabelecimento de uma relação de estrutura-toxicidade entre compostos clássicos e drogas de desenho, com foco na função mitocondrial. Alterações na estrutura química das drogas clássicas, como a anfetamina, parecem afetar diferentemente a toxicidade associada a cada composto derivado. Em conclusão, os resultados sugerem que a disfunção mitocondrial precoce pode ser um marcador sensível e confiável que precede alterações na viabilidade celular, sendo um evento preditor da neurotoxicidade de drogas que pode ser útil para caracterizar novos compostos.
Autores principais:	Ferrão, Rafaela Margarida Cura
Assunto:	Disfunção mitocondrial Biossensor Drogas de abuso Neurotoxicidade Células SH-SY5Y Mitochondrial dysfunction Biosensor Drugs of abuse Neurotoxicity SH-SY5Y cells
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Coimbra
Idioma:	inglês
Origem:	Estudo Geral - Universidade de Coimbra

Descrição
Resumo:	Drogas de abuso afetam a mitocôndria e a sua toxicidade mitocondrial pode ser responsável pelos processos de neurodegeneração. Compreender os mecanismos responsáveis pela toxicidade mitocondrial pode possibilitar o desenvolvimento de estratégias para impedir a neurodegeneração e permitir a previsão do potencial tóxico de novos compostos. Neste trabalho, o nosso objetivo foi identificar marcadores que precedem a neurotoxicidade caracterizada pela perda de viabilidade celular e perceber como é que a mitocôndria intervém na toxicidade celular induzida por drogas de abuso. A primeira tarefa baseou-se na caracterização da ordem cronológica de eventos que precedem a morte celular neuronal desencadeada por drogas de abuso clássicas pertencentes a diferentes classes, incluindo Cocaína, metanfetamina (METH) e Metadona. A segunda tarefa envolveu a aplicação do conhecimento obtido com as drogas clássicas para caracterizar a neurotoxicidade de Mescalina (MESC) e de drogas de desenho como 2,5-dimetoxi-4-bromo-anfetamina (DOB) e 3,4-Metilenodioxianfetamina (MDA).Células SH-SY5Y foram diferenciadas de modo a obter-se um fenótipo neuronal. As células foram expostas a diferentes concentrações das drogas clássicas e os seus efeitos foram analisados após diferentes tempos de exposição, medindo o conteúdo de espécies reativas de oxigénio (ERO) (0-12h), viabilidade celular (ATP (24h), atividade metabólica e massa celular (24-72h)), ativação das caspases 3 e 7 (24h) e perda da integridade da membrana celular (usando Hoechst 33342/Iodeto de Propídeo) (72 e 96h). A polarização mitocondrial e a extensão da rede mitocondrial polarizada foram analisadas usando MitoTracker™ Red CMXRos (24h). O número de cópias do DNA mitocondrial também foi determinado. A significância estatística foi estabelecida para valores de P<0,05. Durante a primeira hora de incubação não houve alterações significativas no conteúdo de EROs no caso da Cocaína e METH; no entanto, para Metadona (0,0391mM) foi observada uma diminuição clara. Após 6h de incubação com 5,00mM de Cocaína, os níveis de EROs parecem ter atingido um plateau. Para o mesmo período, as concentrações de 2,50 e 5,00mM de Cocaína provocaram um aumento significativo no conteúdo de EROs. A exposição a METH e Metadona durante 12h pareceu aumentar ligeiramente os níveis de EROs, mas, curiosamente, não para as concentrações mais altas.Após 24h de exposição, a polarização mitocondrial foi distintamente afetada pelas diferentes drogas de abuso, tendo diminuído para as concentrações mais altas de Cocaína (2,50 e 10,0mM) e aumentado para as concentrações mais altas de METH (0,313 a 2,50mM). A polarização mitocondrial aumentou significativamente para concentrações mais baixas de Metadona (0,0391 e 0,0781mM) e diminuiu ligeiramente para concentrações mais altas (0,156 e 0,313mM). A extensão da rede mitocondrial polarizada diminuiu significativamente para as concentrações mais elevadas de todos os compostos testados (5,00 e 10,0mM de Cocaína, 2,50mM de METH, 0,156 e 0,0313mM de Metadona). Além disso, após 24h, observou-se uma ativação das caspases 3/7 para as concentrações de 2,50 mM de Cocaína, 1,25mM METH e 0,156mM de Metadona. As drogas de abuso (às concentrações testadas) não induziram alterações significativas no número de cópias do mtDNA.Todas as drogas de abuso induziram uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular às 24, 48 e 72h de exposição, em comparação com o controlo. O cálculo dos IC50s, com 24, 48 e 72h de exposição, mostrou que a Metadona apresentou o perfil mais tóxico, seguida pela METH e, por fim, a Cocaína. As drogas de abuso testadas também induziram perda da integridade membranar celular em concentrações mais altas (5.00mM de Cocaína, 1.25 e 2.50mM METH e 0.0781 e 0.156mM Metadona) após 72h, e também para as concentrações de 2.50mM METH e 0.156, 0.313mM Metadona, após 96h.De seguida, avaliou-se a viabilidade celular após exposição a DOB, MDA e MESC de forma a compreender se os mecanismos subjacentes à toxicidade dos derivados são comparáveis aos observados para as drogas clássicas. Resultados preliminares indicaram que DOB foi o composto mais tóxico, e que MDA e MESC parecem induzir efeitos semelhantes. A DOB, à concentração de 0.200mM, também aumentou significativamente a ativação das caspases 3/7, após 24h.Já que DOB e MDA, são derivados da estrutura da anfetamina e similares à MESC, os dados podem contribuir para o estabelecimento de uma relação de estrutura-toxicidade entre compostos clássicos e drogas de desenho, com foco na função mitocondrial. Alterações na estrutura química das drogas clássicas, como a anfetamina, parecem afetar diferentemente a toxicidade associada a cada composto derivado. Em conclusão, os resultados sugerem que a disfunção mitocondrial precoce pode ser um marcador sensível e confiável que precede alterações na viabilidade celular, sendo um evento preditor da neurotoxicidade de drogas que pode ser útil para caracterizar novos compostos.