Publicação

Assessing the impact of silver nanoparticles on cell metabolism: an in vitro NMR metabolomics study

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Face ao uso disseminado e enorme potencial terapêutico das nanopartículas de prata (AgNPs), o estudo dos seus efeitos biológicos é um assunto relevante e atual. O trabalho apresentado nesta tese teve como objetivo aprofundar o conhecimento existente sobre o impacto das AgNPs no metabolismo celular, usando a metabolómica por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Os tipos celulares escolhidos para este estudo foram queratinócitos da epiderme humana, células de hepatoma humano e macrófagos sanguíneos, por serem relevantes, respetivamente, ao nível da entrada, acumulação e captação de nanopartículas no organismo. O Capítulo 1 introduz as principais propriedades das AgNPs, a sua atividade biológica e potencial toxicidade, e descreve a abordagem metabolómica, incluindo uma breve revisão bibliográfica das suas aplicações em nanotoxicologia. O âmbito e os objetivos desta tese são, também, apresentados. O Capítulo 2 descreve os métodos experimentais utilizados ao longo deste trabalho, incluindo a caracterização das AgNPs, os procedimentos usados na cultura celular e nos ensaios biológicos, a colheita e preparação de amostras, a análise por RMN e o tratamento estatístico dos dados. No Capítulo 3, a atividade metabólica e a composição dos três tipos de células usados neste trabalho (queratinócitos HaCaT, células de hepatoma HepG2 e macrófagos RAW 264.7) são descritas com base na análise por RMN dos sobrenadantes dos meios de cultura (exometaboloma) e dos extratos celulares polares e lipofílicos (endometaboloma). O Capítulo 4 apresenta a análise metabolómica das células HaCaT expostas a AgNPs de diferentes tamanhos (10, 30 ou 60 nm de diâmetro) e revestimentos (citrato, polietilenoglicol ou albumina de soro bovino). Verificou-se que o metaboloma celular foi afetado mesmo a concentrações subtóxicas de AgNPs, sugerindo: aumento da glicólise e glutaminólise, alteração na atividade do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) e nos processos de produção e transferência de energia, degradação de proteínas, síntese de glutationa (GSH), modificações a nível das membranas e do equilíbrio osmótico. Apesar de muitas variações serem comuns a todas as nanopartículas testadas, as AgNPs de 10 nm causaram os efeitos mais distintos, nomeadamente no que diz respeito à glicólise e à síntese/utilização de GSH. Além disso, a exposição celular a prata iónica (Ag+) confirmou o importante papel dos iões prata no mecanismo de ação das AgNPs, enquanto a comparação com o peróxido de hidrogénio (H2O2) permitiu destacar os efeitos relacionados com o stress oxidativo. No Capítulo 5 são apresentadas as respostas metabólicas das células de fígado HepG2 a dois tipos de AgNPs, umas obtidas por redução química e estabilizadas em citrato e as outras obtidas por síntese verde na presença de um extrato vegetal (Cit30 e GS30, respetivamente), ambas com centros metálicos de 30 nm. Os resultados sugeriram adaptações metabólicas em processos de produção de energia (metabolismo da glucose e sistema da fosfocreatina), autofagia e metabolismo lipídico, refletindo possivelmente a ativação de mecanismos de proteção. Ainda que os dois tipos de AgNPs tenham induzido muitos efeitos semelhantes, as Cit30 pareceram causar um maior impacto no ciclo TCA e na degradação de proteínas, enquanto as GS30 aparentaram induzir uma diminuição mais forte na síntese de fosfolípidos. A assinatura metabólica da prata iónica foi bastante semelhante à das AgNPs, sugerindo, no entanto, uma menor capacidade das células expostas a Ag+ extracelular para lidar com o stress oxidativo. O Capítulo 6 descreve a avaliação do impacto das AgNPs Cit30 no metaboloma de macrófagos de murganho RAW 264.7, a concentrações subtóxicas (decréscimos de ~5 e 20% na viabilidade celular). As alterações encontradas apontaram para: estimulação da glicólise (a baixa concentração de exposição), reprogramação do ciclo TCA (resultando numa intensa produção de itaconato e succinato e numa marcada depleção de ATP, consistentes com uma resposta pro-inflamatória), ativação da gluconeogénese, promoção da síntese de GSH e acumulação de creatina/fosfocreatina. Foram, ainda, observadas variações possivelmente relacionadas com a osmorregulação e a modificação membranar. De notar que os macrófagos expostos a Ag+ mostraram características semelhantes aos expostos a AgNPs (por ex., aumento da glucose intracelular – gluconeogénese), mas também revelaram efeitos distintos, nomeadamente em metabolitos envolvidos no ciclo TCA, em processos de transferência de energia e no metabolismo lipídico. Adicionalmente, viu-se que o metaboloma dos macrófagos respondeu de maneira diferente à exposição a H2O2 (por ex., tendência para diminuição da glicólise e sem efeitos observados na ativação da gluconeogénese ou da síntese de GSH), indicando que muitos dos efeitos induzidos pelas AgNPs não foram necessariamente mediados por stress oxidativo. Finalmente, com base na integração dos resultados apresentados ao longo dos capítulos anteriores, as principais conclusões deste trabalho são apresentadas e discutidas no Capítulo 7.
Autores principais:	Carrola, Joana Carolina Quintela
Assunto:	Nanotecnologia Metabolismo celular Nanopartículas - Prata Espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Aveiro
Idioma:	inglês
Origem:	RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro

Descrição
Resumo:	Face ao uso disseminado e enorme potencial terapêutico das nanopartículas de prata (AgNPs), o estudo dos seus efeitos biológicos é um assunto relevante e atual. O trabalho apresentado nesta tese teve como objetivo aprofundar o conhecimento existente sobre o impacto das AgNPs no metabolismo celular, usando a metabolómica por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Os tipos celulares escolhidos para este estudo foram queratinócitos da epiderme humana, células de hepatoma humano e macrófagos sanguíneos, por serem relevantes, respetivamente, ao nível da entrada, acumulação e captação de nanopartículas no organismo. O Capítulo 1 introduz as principais propriedades das AgNPs, a sua atividade biológica e potencial toxicidade, e descreve a abordagem metabolómica, incluindo uma breve revisão bibliográfica das suas aplicações em nanotoxicologia. O âmbito e os objetivos desta tese são, também, apresentados. O Capítulo 2 descreve os métodos experimentais utilizados ao longo deste trabalho, incluindo a caracterização das AgNPs, os procedimentos usados na cultura celular e nos ensaios biológicos, a colheita e preparação de amostras, a análise por RMN e o tratamento estatístico dos dados. No Capítulo 3, a atividade metabólica e a composição dos três tipos de células usados neste trabalho (queratinócitos HaCaT, células de hepatoma HepG2 e macrófagos RAW 264.7) são descritas com base na análise por RMN dos sobrenadantes dos meios de cultura (exometaboloma) e dos extratos celulares polares e lipofílicos (endometaboloma). O Capítulo 4 apresenta a análise metabolómica das células HaCaT expostas a AgNPs de diferentes tamanhos (10, 30 ou 60 nm de diâmetro) e revestimentos (citrato, polietilenoglicol ou albumina de soro bovino). Verificou-se que o metaboloma celular foi afetado mesmo a concentrações subtóxicas de AgNPs, sugerindo: aumento da glicólise e glutaminólise, alteração na atividade do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) e nos processos de produção e transferência de energia, degradação de proteínas, síntese de glutationa (GSH), modificações a nível das membranas e do equilíbrio osmótico. Apesar de muitas variações serem comuns a todas as nanopartículas testadas, as AgNPs de 10 nm causaram os efeitos mais distintos, nomeadamente no que diz respeito à glicólise e à síntese/utilização de GSH. Além disso, a exposição celular a prata iónica (Ag+) confirmou o importante papel dos iões prata no mecanismo de ação das AgNPs, enquanto a comparação com o peróxido de hidrogénio (H2O2) permitiu destacar os efeitos relacionados com o stress oxidativo. No Capítulo 5 são apresentadas as respostas metabólicas das células de fígado HepG2 a dois tipos de AgNPs, umas obtidas por redução química e estabilizadas em citrato e as outras obtidas por síntese verde na presença de um extrato vegetal (Cit30 e GS30, respetivamente), ambas com centros metálicos de 30 nm. Os resultados sugeriram adaptações metabólicas em processos de produção de energia (metabolismo da glucose e sistema da fosfocreatina), autofagia e metabolismo lipídico, refletindo possivelmente a ativação de mecanismos de proteção. Ainda que os dois tipos de AgNPs tenham induzido muitos efeitos semelhantes, as Cit30 pareceram causar um maior impacto no ciclo TCA e na degradação de proteínas, enquanto as GS30 aparentaram induzir uma diminuição mais forte na síntese de fosfolípidos. A assinatura metabólica da prata iónica foi bastante semelhante à das AgNPs, sugerindo, no entanto, uma menor capacidade das células expostas a Ag+ extracelular para lidar com o stress oxidativo. O Capítulo 6 descreve a avaliação do impacto das AgNPs Cit30 no metaboloma de macrófagos de murganho RAW 264.7, a concentrações subtóxicas (decréscimos de ~5 e 20% na viabilidade celular). As alterações encontradas apontaram para: estimulação da glicólise (a baixa concentração de exposição), reprogramação do ciclo TCA (resultando numa intensa produção de itaconato e succinato e numa marcada depleção de ATP, consistentes com uma resposta pro-inflamatória), ativação da gluconeogénese, promoção da síntese de GSH e acumulação de creatina/fosfocreatina. Foram, ainda, observadas variações possivelmente relacionadas com a osmorregulação e a modificação membranar. De notar que os macrófagos expostos a Ag+ mostraram características semelhantes aos expostos a AgNPs (por ex., aumento da glucose intracelular – gluconeogénese), mas também revelaram efeitos distintos, nomeadamente em metabolitos envolvidos no ciclo TCA, em processos de transferência de energia e no metabolismo lipídico. Adicionalmente, viu-se que o metaboloma dos macrófagos respondeu de maneira diferente à exposição a H2O2 (por ex., tendência para diminuição da glicólise e sem efeitos observados na ativação da gluconeogénese ou da síntese de GSH), indicando que muitos dos efeitos induzidos pelas AgNPs não foram necessariamente mediados por stress oxidativo. Finalmente, com base na integração dos resultados apresentados ao longo dos capítulos anteriores, as principais conclusões deste trabalho são apresentadas e discutidas no Capítulo 7.