Publicação
Clivagem e caracterização de frutalina recombinante produzida em Escherichia coli
| Resumo: | A frutalina é uma lectina extraída de sementes de fruta-pão (Artocarpus incisa). É uma proteína glicosilada com peso molecular de 48-49 kDa e organizada em tetrâmeros, sendo cada um composto por uma cadeia α e uma cadeia β . É uma lectina do grupo das jacalinas com afinidade de ligação a galactose e com aplicações biomédicas como biomarcador, imunomodulador e propriedades anti-tumorais. A frutalina é, no entanto, composta por várias isoformas que a tornam uma mistura heterogénea e cuja quantidade relativa de cada uma das isoformas varia de extração para extração. A introdução de tecnologia recombinante permite obter uma solução com uma única isoforma com propriedades definidas e permite a inclusão de parceiros de fusão por forma a melhorar os rendimentos de produção e facilitar a sua purificação e reduzir as perdas associadas ao processo. Estudos anteriores demonstraram atividade citotóxica de frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris mesmo não ocorrendo a excisão do linker entre as cadeias a e b. O mesmo não aconteceu com frutalina recombinante produzida em Escherichia coli que não demonstrou atividade citotóxica. O presente trabalho pretende caracterizar uma versão de frutalina recombinante produzida em E. coli contendo como parceiro de fusão o promotor de solubilidade Trx e uma cauda de histidinas por forma a facilitar a sua purificação (TrxFTL). Esta versão de frutalina contem ainda dois locais de ação da TEV protease: um entre as cadeias e outro que separa as cadeias do parceiro de fusão. A análise SDS-PAGE indica que digestão com TEV protease removeu o parceiro de fusão, no entanto é inconclusiva quanto à separação das cadeias. O método de purificação usado, a cromatografia de afinidade ao níquel reversa demonstrou ser um método eficaz na purificação da frutalina clivada (rFTL). A frutalina recombinante não demonstrou atividade hemaglutinante em hemácias de coelho, quer antes quer após digestão. Embora a rFTL tenha demonstrado afinidade à metil-α-D-galactose em ensaios de fluorescência, não apresentou afinidade à galactomanana reticulada de Adenanthera pavonina. Foi ainda efetuada a desnaturação da TrxFTL e rFTL, para aumentar a acessibilidade da TEV protease, tendo resultado, no caso da TrxFTL, num aumento do comprimento de onda de intensidade de fluorescência máxima e numa diminuição de intensidade de fluorescência. |
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| Autores principais: | Frias, Vítor Hugo Afonso |
| Assunto: | Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia Industrial |
| Ano: | 2015 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | português |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | A frutalina é uma lectina extraída de sementes de fruta-pão (Artocarpus incisa). É uma proteína glicosilada com peso molecular de 48-49 kDa e organizada em tetrâmeros, sendo cada um composto por uma cadeia α e uma cadeia β . É uma lectina do grupo das jacalinas com afinidade de ligação a galactose e com aplicações biomédicas como biomarcador, imunomodulador e propriedades anti-tumorais. A frutalina é, no entanto, composta por várias isoformas que a tornam uma mistura heterogénea e cuja quantidade relativa de cada uma das isoformas varia de extração para extração. A introdução de tecnologia recombinante permite obter uma solução com uma única isoforma com propriedades definidas e permite a inclusão de parceiros de fusão por forma a melhorar os rendimentos de produção e facilitar a sua purificação e reduzir as perdas associadas ao processo. Estudos anteriores demonstraram atividade citotóxica de frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris mesmo não ocorrendo a excisão do linker entre as cadeias a e b. O mesmo não aconteceu com frutalina recombinante produzida em Escherichia coli que não demonstrou atividade citotóxica. O presente trabalho pretende caracterizar uma versão de frutalina recombinante produzida em E. coli contendo como parceiro de fusão o promotor de solubilidade Trx e uma cauda de histidinas por forma a facilitar a sua purificação (TrxFTL). Esta versão de frutalina contem ainda dois locais de ação da TEV protease: um entre as cadeias e outro que separa as cadeias do parceiro de fusão. A análise SDS-PAGE indica que digestão com TEV protease removeu o parceiro de fusão, no entanto é inconclusiva quanto à separação das cadeias. O método de purificação usado, a cromatografia de afinidade ao níquel reversa demonstrou ser um método eficaz na purificação da frutalina clivada (rFTL). A frutalina recombinante não demonstrou atividade hemaglutinante em hemácias de coelho, quer antes quer após digestão. Embora a rFTL tenha demonstrado afinidade à metil-α-D-galactose em ensaios de fluorescência, não apresentou afinidade à galactomanana reticulada de Adenanthera pavonina. Foi ainda efetuada a desnaturação da TrxFTL e rFTL, para aumentar a acessibilidade da TEV protease, tendo resultado, no caso da TrxFTL, num aumento do comprimento de onda de intensidade de fluorescência máxima e numa diminuição de intensidade de fluorescência. |
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