Publicação

Estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas para a utilização de lactose : construção e aplicação biotecnológica

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A biotecnologia, por definição, envolve a utilização de organismos vivos ou de componentes celulares derivados de organismos vivos. A tecnologia do ADN recombinante, devido à sua capacidade de efectuar alterações nas características de um organismo vivo, pode teoricamente ser empregue para modificar ou melhorar qualquer processo biotecnológico. No entanto, para que uma abordagem deste tipo seja bem sucedida é necessário que seja efectuada de forma híbrida entre a genética aplicada e o próprio processo. Desta forma, ao efectuar alterações ao nível da biologia molecular deve-se ter em conta o processo ao qual se pretende aplicar. Uma vez construído o novo microrganismo, a operação em biorreactor e optimização do processo não pode ignorar as suas características de microrganismo recombinante. Com o presente trabalho pretendeu-se contribuir para o melhoramento do processo biotecnológico de tratamento do soro de queijo através da construção de estirpes de Saccharoinyces cerevisiae floculantes utilizadoras de lactose. Inicialmente, a estirpe floculante S. cerevisiae NCYC869-A3/T1 capaz de metabolizar e fermentar a lactose, através da utilização dos genes de Kluyveromyces lactis, LAC4 (codificador para a ß-galactosidase) e LACI2 (codificador para a permease da lactose), apresentava algumas limitações na metabolização de lactose, fermentação em etanol e floculação que foram ultrapassadas. Esta estirpe recombinante foi estudada em sistema contínuo de elevada densidade celular, permitindo a obtenção de cerca de 11 g1¹h¹ de etanol quando operado com meio semi-sintético à taxa de diluição de 0,5 h¹. A utilização de permeado de soro como substrato para fermentação alcoólica foi testada, obtendo-se uma produtividade em etanol de cerca de 10 g1¹h¹ para o sistema operado a 0,45 h¹ de taxa de diluição. A utilização de concentrado de permeado de soro de queijo para diminuir os custos de destilação foi avaliada, tendo-se comprovado a capacidade da estirpe recombinante na fermentação de etanol para valores próximos do teoricamente esperado. No entanto, a operação em contínuo em sistema de elevada densidade celular não foi possível devido à desfioculação da biomassa. A utilização conjunta desta estirpe recombinante de levedura e uma estirpe de E. coli recombinante produtora da proteína GFP, permitiu confirmar a resistência destes sistemas a contaminações quando operados a taxas de diluição suficientemente elevadas. Construíram-se também estirpes S. cerevisiae floculantes e não floculantes, excretoras de ß-galactosidase através da clonagem do gene lacA de Aspergilius niger. A comparação de estirpes floculantes e não floculantes com o mesmo património genético permitiu verificar da viabilidade da produção de ß-galactosidase extracelular por células floculantes. Uma das estirpes construídas apresentou produção de ß-galactosidase comparável à obtida em sistemas comerciais de produção da enzima por fungos. Foi possível comprovar a pureza com que esta enzima é excretada para o meio extracelular, assim como a manutenção das suas propriedades, nomeadamente o óptimo de pH e de temperatura. A produção de ß-galactosidase pela estirpe recombinante foi estudada em sistema descontínuo e semi-contínuo tendo-se avaliado o efeito de diferentes parâmetros tais como, concentração inicial de lactose, taxa de arejamento e concentração de extracto de levedura. Verificou-se que o melhor sistema para produção de ß-galactosidase correspondia à concentração inicial de lactose de 100 g1¹ e 10 g1¹ de extracto de levedura com micro-arejamento. Aplicou-se a estirpe construída a sistema contínuo de elevada densidade celular, obtendo-se uma produtividade cerca de 6 vezes superior à obtida em sistema descontínuo. Foram também testados o permeado e o concentrado do permeado de soro de queijo como substrato, aplicando-se a enzima produzida à hidrólise do permeado de soro de queijo. Finalmente, desenvolveu-se uma estratégia para obtenção de estirpes modificadas com um plasmídeo contendo o gene de floculação e o de produção da ß-galactosidase. A obtenção da referida estirpe permitirá operar num sistema auto-selectivo, desde que se assegure a existência de uma cultura contínua de elevada densidade celular com capacidade de selecção de células floculantes. A estratégia desenvolvida para a construção do plasmídeo é apresentada e discutida.
Autores principais:	Domingues, Lucília
Assunto:	Floculação Lactose Genética de leveduras Saccharomyces cerevisiae Soro de queijo Etanol ß-galactosidade Sistemas de elevada densidade celular Flocculation Yeast genetics Cheese whey Ethanol High cell density systems
Ano:	2001
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	português
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	A biotecnologia, por definição, envolve a utilização de organismos vivos ou de componentes celulares derivados de organismos vivos. A tecnologia do ADN recombinante, devido à sua capacidade de efectuar alterações nas características de um organismo vivo, pode teoricamente ser empregue para modificar ou melhorar qualquer processo biotecnológico. No entanto, para que uma abordagem deste tipo seja bem sucedida é necessário que seja efectuada de forma híbrida entre a genética aplicada e o próprio processo. Desta forma, ao efectuar alterações ao nível da biologia molecular deve-se ter em conta o processo ao qual se pretende aplicar. Uma vez construído o novo microrganismo, a operação em biorreactor e optimização do processo não pode ignorar as suas características de microrganismo recombinante. Com o presente trabalho pretendeu-se contribuir para o melhoramento do processo biotecnológico de tratamento do soro de queijo através da construção de estirpes de Saccharoinyces cerevisiae floculantes utilizadoras de lactose. Inicialmente, a estirpe floculante S. cerevisiae NCYC869-A3/T1 capaz de metabolizar e fermentar a lactose, através da utilização dos genes de Kluyveromyces lactis, LAC4 (codificador para a ß-galactosidase) e LACI2 (codificador para a permease da lactose), apresentava algumas limitações na metabolização de lactose, fermentação em etanol e floculação que foram ultrapassadas. Esta estirpe recombinante foi estudada em sistema contínuo de elevada densidade celular, permitindo a obtenção de cerca de 11 g1¹h¹ de etanol quando operado com meio semi-sintético à taxa de diluição de 0,5 h¹. A utilização de permeado de soro como substrato para fermentação alcoólica foi testada, obtendo-se uma produtividade em etanol de cerca de 10 g1¹h¹ para o sistema operado a 0,45 h¹ de taxa de diluição. A utilização de concentrado de permeado de soro de queijo para diminuir os custos de destilação foi avaliada, tendo-se comprovado a capacidade da estirpe recombinante na fermentação de etanol para valores próximos do teoricamente esperado. No entanto, a operação em contínuo em sistema de elevada densidade celular não foi possível devido à desfioculação da biomassa. A utilização conjunta desta estirpe recombinante de levedura e uma estirpe de E. coli recombinante produtora da proteína GFP, permitiu confirmar a resistência destes sistemas a contaminações quando operados a taxas de diluição suficientemente elevadas. Construíram-se também estirpes S. cerevisiae floculantes e não floculantes, excretoras de ß-galactosidase através da clonagem do gene lacA de Aspergilius niger. A comparação de estirpes floculantes e não floculantes com o mesmo património genético permitiu verificar da viabilidade da produção de ß-galactosidase extracelular por células floculantes. Uma das estirpes construídas apresentou produção de ß-galactosidase comparável à obtida em sistemas comerciais de produção da enzima por fungos. Foi possível comprovar a pureza com que esta enzima é excretada para o meio extracelular, assim como a manutenção das suas propriedades, nomeadamente o óptimo de pH e de temperatura. A produção de ß-galactosidase pela estirpe recombinante foi estudada em sistema descontínuo e semi-contínuo tendo-se avaliado o efeito de diferentes parâmetros tais como, concentração inicial de lactose, taxa de arejamento e concentração de extracto de levedura. Verificou-se que o melhor sistema para produção de ß-galactosidase correspondia à concentração inicial de lactose de 100 g1¹ e 10 g1¹ de extracto de levedura com micro-arejamento. Aplicou-se a estirpe construída a sistema contínuo de elevada densidade celular, obtendo-se uma produtividade cerca de 6 vezes superior à obtida em sistema descontínuo. Foram também testados o permeado e o concentrado do permeado de soro de queijo como substrato, aplicando-se a enzima produzida à hidrólise do permeado de soro de queijo. Finalmente, desenvolveu-se uma estratégia para obtenção de estirpes modificadas com um plasmídeo contendo o gene de floculação e o de produção da ß-galactosidase. A obtenção da referida estirpe permitirá operar num sistema auto-selectivo, desde que se assegure a existência de uma cultura contínua de elevada densidade celular com capacidade de selecção de células floculantes. A estratégia desenvolvida para a construção do plasmídeo é apresentada e discutida.