Publicação

Molecular and physiological approaches towards the characterisation of glycerol transport in Saccharomyces Cerevisiae

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A adaptação fisiológica de células de Saccharomyces cerevisiae a condições de stresse salino envolve a acumulação intracelular de glicerol como soluto compatível. A concentração citoplasmática de glicerol é regulada permitindo a manutenção do equilíbrio da actividade da água entre o compartimento celular e o meio externo. Em células cultivadas em meios contendo açúcares fermentescíveis, tal como na maior parte dos habitats naturais de levedura, o glicerol é produzido por redução do intermediário metabólico gliceraldeído 3- fosfato, com envolvimento de NADH, e posterior desfosforilação. Uma vez que o cofactor NADH é produzido na glicólise, um mecanismo disponível para a regeneração de NAD+ em condições de anaerobiose é através da síntese de glicerol. Assim, a elevada produção de glicerol é uma consequência fisiológica da fermentação em S. cerevisiae. Este glicerol sintetisado é libertado para o meio, permitindo a sua síntese continuada e regulação permanente do potencial redox. O incremento da síntese de glicerol como resposta a stresse osmótico é mediada pelo aumento da expressão de GPD1, que codifica a enzima glicerol 3- fosfato desidrogenase, e do gene GPP2 que codifica a enzima glicerol 3-fosfato fosfatase. A acumulação é também conseguida por retenção de glicerol através do decréscimo da permeabilidade da membrana citoplasmática. O canal de glicerol Fps1p está envolvido nesta modificação da permeabilidade por um mecanismo de abertura e fechamento do poro. Por outro lado, uma influência na composição lipídica da membrana citoplasmática tem sido atribuída ao gene FPS1, podendo levar à diminuição da permeabilidade ao glicerol. Neste trabalho são apresentados resultados que apontam para a identificação dos genes que codificam os sistemas de transporte activo do glicerol. O gene GUP1, previamente clonado através da dificuldade em utilização de glicerol como fonte de carbono e energia do respectivo mutante, é demonstrado neste trabalho estar envolvido no transporte activo de glicerol. Apesar de em mutantes gup1 ser detectada uma cinética de saturação no transporte de glicerol, apenas em mutantes gup1gut1 a componente de saturação do transporte de glicerol é completamente suprimida. A interferência do primeiro passo do catabolismo de glicerol, catalisado pela enzima glicerol cinase codificada pelo gene GUT1, na determinação experimental de transporte de glicerol em células desreprimidas é coerente com estes resultados. Em células cultivadas em glucose, o transporte activo de glicerol só foi detectado em células incapazes de sintetisar glicerol (fundo genético gpd1gpd2) na presença de stresse salino e de pequenas quantidades de glicerol no meio. Em mutantes com mutações adicionais nos genes GUP1 e GUT1, este transporte continua a ser detectado. Um gene homólogo, posteriormente designado GUP2, foi demonstrado estar envolvido neste transporte uma vez que só se deixou de detectar transporte no mutante gpd1gup1gup2. O envolvimento do transporte activo de glicerol na resposta a stresse osmótico tem sido sugerido por resultados já publicados para os genes GUP1 e GUP2. A análise de expressão por quantificação relativa de mRNA por RT-PCR foi feita para confirmação deste envolvimento. Os níveis de mRNA detectados não foram coerentes com os resultados dos ensaios de transporte activo de glicerol marcado radioactivamente, uma vez que foram relativamente constantes para GUP1 e GUP2. A possibilidade de regulação negativa por parte do glicerol sobre o transporte foi excluída devido à falta de correlação entre os valores de concentração intracelular e os resultados de transporte activo de glicerol. A possibilidade de crescimento sob stresse salino severo de mutantes incapazes de sintetisar glicerol, aponta para a participação da via da dihidroxiacetona na Sumário síntese de glicerol. Esta conclusão é também apoiada na detecção de quantidades significativas deste composto no interior destas células mutantes. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal de glicerol Fps1p foi também investigado neste trabalho devido à incoerência de resultados, publicados previamente, de ensaios de transporte e o tipo de transporte aceite para este sistema. Uma vez que em mutantes fps1 é detectada uma cinética de saturação para a entrada de glicerol apenas em células cultivadas em glucose e colhidas na transição de metabolismo fermentativo para respiratório, uma possível interferência nos ensaios de transporte por desrepressão parcial do gene GUT1 foi postulada. Na pesquisa de um componente saturável na cinética de transporte de glicerol nas condições referidas, apenas em mutantes gut1 não se detectou este componente. Assim, com base nestes resultados e em resultados publicados sobre decréscimo da difusão passiva em mutantes fps1 e na baixa lipossolubilidade da molécula de glicerol, o mecanismo de difusão simples através do canal Fps1p, em oposição à difusão facilitada, é sugerido neste trabalho. Neste trabalho, os mecanismos de transporte transmembranar de glicerol foram estudados e caracterizados. A clonagem dos genes que codificam os sistemas de transporte activo de glicerol foi obtida com o contributo deste trabalho na caracterização dos sistemas de transporte a nível fisiológico e a nível da expressão destes genes, incluindo o envolvimento na resposta a stresse osmótico. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal Fps1p foi elucidado e a difusão simples através da bicamada lipídica da membrana plasmática também foi investigada. Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível melhorar o modelo de transporte de glicerol que inclui quatro situações fisiológicas: repressão catabólica, desrepressão, desrepressão parcial e stresse salino. A expressão a nível da transcrição dos genes GUP1 e GUP2 é constante nestas condições e o transporte activo de glicerol só é detectado em células desreprimidas e em células sujeitas a stresse salino desde que incapacitadas de sintesar glicerol. A difusão simples é maioritariamente mediada pelo canal Fps1p e, tal como demonstrado previamente, é abolida sob stresse salino, permitindo retenção intracelular do glicerol.
Autores principais:	Oliveira, Rui Pedro Soares de
Ano:	2003
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	inglês
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	A adaptação fisiológica de células de Saccharomyces cerevisiae a condições de stresse salino envolve a acumulação intracelular de glicerol como soluto compatível. A concentração citoplasmática de glicerol é regulada permitindo a manutenção do equilíbrio da actividade da água entre o compartimento celular e o meio externo. Em células cultivadas em meios contendo açúcares fermentescíveis, tal como na maior parte dos habitats naturais de levedura, o glicerol é produzido por redução do intermediário metabólico gliceraldeído 3- fosfato, com envolvimento de NADH, e posterior desfosforilação. Uma vez que o cofactor NADH é produzido na glicólise, um mecanismo disponível para a regeneração de NAD+ em condições de anaerobiose é através da síntese de glicerol. Assim, a elevada produção de glicerol é uma consequência fisiológica da fermentação em S. cerevisiae. Este glicerol sintetisado é libertado para o meio, permitindo a sua síntese continuada e regulação permanente do potencial redox. O incremento da síntese de glicerol como resposta a stresse osmótico é mediada pelo aumento da expressão de GPD1, que codifica a enzima glicerol 3- fosfato desidrogenase, e do gene GPP2 que codifica a enzima glicerol 3-fosfato fosfatase. A acumulação é também conseguida por retenção de glicerol através do decréscimo da permeabilidade da membrana citoplasmática. O canal de glicerol Fps1p está envolvido nesta modificação da permeabilidade por um mecanismo de abertura e fechamento do poro. Por outro lado, uma influência na composição lipídica da membrana citoplasmática tem sido atribuída ao gene FPS1, podendo levar à diminuição da permeabilidade ao glicerol. Neste trabalho são apresentados resultados que apontam para a identificação dos genes que codificam os sistemas de transporte activo do glicerol. O gene GUP1, previamente clonado através da dificuldade em utilização de glicerol como fonte de carbono e energia do respectivo mutante, é demonstrado neste trabalho estar envolvido no transporte activo de glicerol. Apesar de em mutantes gup1 ser detectada uma cinética de saturação no transporte de glicerol, apenas em mutantes gup1gut1 a componente de saturação do transporte de glicerol é completamente suprimida. A interferência do primeiro passo do catabolismo de glicerol, catalisado pela enzima glicerol cinase codificada pelo gene GUT1, na determinação experimental de transporte de glicerol em células desreprimidas é coerente com estes resultados. Em células cultivadas em glucose, o transporte activo de glicerol só foi detectado em células incapazes de sintetisar glicerol (fundo genético gpd1gpd2) na presença de stresse salino e de pequenas quantidades de glicerol no meio. Em mutantes com mutações adicionais nos genes GUP1 e GUT1, este transporte continua a ser detectado. Um gene homólogo, posteriormente designado GUP2, foi demonstrado estar envolvido neste transporte uma vez que só se deixou de detectar transporte no mutante gpd1gup1gup2. O envolvimento do transporte activo de glicerol na resposta a stresse osmótico tem sido sugerido por resultados já publicados para os genes GUP1 e GUP2. A análise de expressão por quantificação relativa de mRNA por RT-PCR foi feita para confirmação deste envolvimento. Os níveis de mRNA detectados não foram coerentes com os resultados dos ensaios de transporte activo de glicerol marcado radioactivamente, uma vez que foram relativamente constantes para GUP1 e GUP2. A possibilidade de regulação negativa por parte do glicerol sobre o transporte foi excluída devido à falta de correlação entre os valores de concentração intracelular e os resultados de transporte activo de glicerol. A possibilidade de crescimento sob stresse salino severo de mutantes incapazes de sintetisar glicerol, aponta para a participação da via da dihidroxiacetona na Sumário síntese de glicerol. Esta conclusão é também apoiada na detecção de quantidades significativas deste composto no interior destas células mutantes. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal de glicerol Fps1p foi também investigado neste trabalho devido à incoerência de resultados, publicados previamente, de ensaios de transporte e o tipo de transporte aceite para este sistema. Uma vez que em mutantes fps1 é detectada uma cinética de saturação para a entrada de glicerol apenas em células cultivadas em glucose e colhidas na transição de metabolismo fermentativo para respiratório, uma possível interferência nos ensaios de transporte por desrepressão parcial do gene GUT1 foi postulada. Na pesquisa de um componente saturável na cinética de transporte de glicerol nas condições referidas, apenas em mutantes gut1 não se detectou este componente. Assim, com base nestes resultados e em resultados publicados sobre decréscimo da difusão passiva em mutantes fps1 e na baixa lipossolubilidade da molécula de glicerol, o mecanismo de difusão simples através do canal Fps1p, em oposição à difusão facilitada, é sugerido neste trabalho. Neste trabalho, os mecanismos de transporte transmembranar de glicerol foram estudados e caracterizados. A clonagem dos genes que codificam os sistemas de transporte activo de glicerol foi obtida com o contributo deste trabalho na caracterização dos sistemas de transporte a nível fisiológico e a nível da expressão destes genes, incluindo o envolvimento na resposta a stresse osmótico. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal Fps1p foi elucidado e a difusão simples através da bicamada lipídica da membrana plasmática também foi investigada. Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível melhorar o modelo de transporte de glicerol que inclui quatro situações fisiológicas: repressão catabólica, desrepressão, desrepressão parcial e stresse salino. A expressão a nível da transcrição dos genes GUP1 e GUP2 é constante nestas condições e o transporte activo de glicerol só é detectado em células desreprimidas e em células sujeitas a stresse salino desde que incapacitadas de sintesar glicerol. A difusão simples é maioritariamente mediada pelo canal Fps1p e, tal como demonstrado previamente, é abolida sob stresse salino, permitindo retenção intracelular do glicerol.