Publicação
Addressing lactone production bottlenecks through Ashbya gossypii engineering and fermentation optimization
| Resumo: | O presente estudo investigou o desenvolvimento de um bioprocesso otimizado para a produção de novo de γ-decalactona utilizando estirpes de Ashbya gossypii geneticamente modificadas. Foram abordados desafios cruciais, como limitações de oxigénio, uso de sistemas de high throughput e citotoxicidade das lactonas, através de engenharia metabólica e otimização do processo. A expressão heteróloga da hemoglobina de Vitreoscilla (VHb) melhorou significativamente a transferência de oxigénio e a atividade metabólica, resultando num aumento de três vezes na produção de biomassa (17,2 g/L) e num aumento de duas vezes no título de γ-decalactona (50,6 mg/L) em fermentações em biorreator, em comparação com a estirpe selvagem. Os ensaios de tamponamento revelaram que o tampão de fosfato a 50 mM proporcionou a melhor estabilidade de pH (queda de apenas 4,4%) e o maior rendimento de γ-decalactona (163,9 mg/L), superando o carbonato de cálcio e os tampões MES. Ensaios de citotoxicidade indicaram que concentrações de γ-decalactona superiores a 350 mg/L reduziram o crescimento radial do fungo entre 15% e 18% em relação ao controlo, sugerindo efeitos da morfologia micelial na mitigação da toxicidade. Estudos sobre transportadores de oxigénio mostraram que a perfluorodecalina (PFD) aumentou a produção de γ-decalactona em condições de limitação de oxigénio, quando combinada com a estirpe AVHb em altas concentrações de meio, embora não tenham sido observadas melhorias para outras estirpes e concentrações de meio testadas. Experiências de concentração do meio demonstraram que a eficiência específica de produção aumentou de 37,7 mg/[N] no meio não diluído para 94,7 mg/[N] numa diluição de 1:4, destacando o défice de oxigénio em concentrações mais altas e a dependência do oxigénio pela via do β-oxidação. Além disso, estes resultados destacaram a capacidade da AVHb de atenuar a sobrecarga metabólica causada pela baixa oxigenação, funcionando como um sistema de entrega de oxigénio dentro da célula. Estes resultados demonstram que uma estratégia combinada de modificação genética e otimização do processo pode ser eficaz para aumentar a eficiência da produção. Futuras otimizações poderão focar-se na combinação da expressão de VHb com a sobre-expressão da desaturase (DES589) para maximizar a disponibilidade de precursores e o fluxo metabólico, assim como na melhoria das condições de suplementação de PFD para garantir a oxigenação sem cisalhamento. Este trabalho estabelece A. gossypii como uma plataforma robusta e escalável para a produção de γ-decalactona, apoiando processos industriais bioeconómicos e princípios de economia circular. |
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| Autores principais: | Freitas, José Luís da Silva |
| Assunto: | γ-decalactona Ashbya gossypii Engenharia metabólica Engenharia de processo Metabolic engineering Process engineering Engenharia e Tecnologia |
| Ano: | 2025 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso restrito |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | O presente estudo investigou o desenvolvimento de um bioprocesso otimizado para a produção de novo de γ-decalactona utilizando estirpes de Ashbya gossypii geneticamente modificadas. Foram abordados desafios cruciais, como limitações de oxigénio, uso de sistemas de high throughput e citotoxicidade das lactonas, através de engenharia metabólica e otimização do processo. A expressão heteróloga da hemoglobina de Vitreoscilla (VHb) melhorou significativamente a transferência de oxigénio e a atividade metabólica, resultando num aumento de três vezes na produção de biomassa (17,2 g/L) e num aumento de duas vezes no título de γ-decalactona (50,6 mg/L) em fermentações em biorreator, em comparação com a estirpe selvagem. Os ensaios de tamponamento revelaram que o tampão de fosfato a 50 mM proporcionou a melhor estabilidade de pH (queda de apenas 4,4%) e o maior rendimento de γ-decalactona (163,9 mg/L), superando o carbonato de cálcio e os tampões MES. Ensaios de citotoxicidade indicaram que concentrações de γ-decalactona superiores a 350 mg/L reduziram o crescimento radial do fungo entre 15% e 18% em relação ao controlo, sugerindo efeitos da morfologia micelial na mitigação da toxicidade. Estudos sobre transportadores de oxigénio mostraram que a perfluorodecalina (PFD) aumentou a produção de γ-decalactona em condições de limitação de oxigénio, quando combinada com a estirpe AVHb em altas concentrações de meio, embora não tenham sido observadas melhorias para outras estirpes e concentrações de meio testadas. Experiências de concentração do meio demonstraram que a eficiência específica de produção aumentou de 37,7 mg/[N] no meio não diluído para 94,7 mg/[N] numa diluição de 1:4, destacando o défice de oxigénio em concentrações mais altas e a dependência do oxigénio pela via do β-oxidação. Além disso, estes resultados destacaram a capacidade da AVHb de atenuar a sobrecarga metabólica causada pela baixa oxigenação, funcionando como um sistema de entrega de oxigénio dentro da célula. Estes resultados demonstram que uma estratégia combinada de modificação genética e otimização do processo pode ser eficaz para aumentar a eficiência da produção. Futuras otimizações poderão focar-se na combinação da expressão de VHb com a sobre-expressão da desaturase (DES589) para maximizar a disponibilidade de precursores e o fluxo metabólico, assim como na melhoria das condições de suplementação de PFD para garantir a oxigenação sem cisalhamento. Este trabalho estabelece A. gossypii como uma plataforma robusta e escalável para a produção de γ-decalactona, apoiando processos industriais bioeconómicos e princípios de economia circular. |
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