Publicação

Estudo de diferentes sistemas de produção e purificação de frutalina recombinante com vista à sua aplicação biomédica

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A frutalina é a principal lectina de sementes da fruta-pão (Artocarpus incisa). Esta lectina é uma glicoproteína tetramérica, parcialmente glicosilada e pertencente à sub-família das lectinas relacionadas com a jacalina com afinidade de ligação a resíduos de D-galactose. Em estudos anteriores a frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris e purificada por cromatografia de exclusão molecular (SEC) mostrou ter um potente efeito citotóxico em células do cancro do cólon do útero (HeLa) e do adenocarcinoma do cólon (HCT 116), sendo este efeito devido à indução de morte celular por apoptose por uma via dependente das caspases e independente da p53. No entanto a purificação por SEC limita a aplicação da frutalina recombinante uma vez que é um processo demorado e resulta em amostras muito diluídas, pelo que metodologias alternativas à sua purificação são necessárias. Por outro lado, a Escherichia coli, como sistema de expressão, permite um processo de produção e purificação mais eficiente contudo as versões resultantes não têm efeito citotóxico. Assim, com o presente trabalho pretendeu-se avaliar o efeito citotóxico de versões de frutalina recombinante produzidas em E. coli, bem como de versões produzidas em P. pastoris e purificadas por diferentes metodologias, nomeadamente cromatografia de exclusão molecular (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia de afinidade ao níquel (IMAC-Ni). Para atingir este objetivo foram testadas duas versões de frutalina produzidas em E. coli, uma delas contendo o tag His6 (EcrHis6FTL) e outra resultante da clivagem do Fh8 da versão EcrFh8FTL (EcrCFTL), em linhas tumorais humanas com (HCT 116 p53+/+) e sem a forma nativa da p53 (HCT 116 p53-/-), e nenhuma destas versões mostrou ter efeito anti-proliferativo em ambas as linhas tumorais. O que sugere que a glicosilação assume um papel importante na atividade da frutalina e a ausência desta resulta na inexistência de atividade anti-proliferativa. Por outro lado, foram produzidas versões de frutalina em P. pastoris, versões glicosiladas, e usadas 3 metodologias de purificação distintas, SEC, HIC e IMAC-Ni. A purificação por HIC e IMAC-Ni não se revelou eficiente contrariamente à purificação por SEC. A frutalina purificada por SEC é estável estruturalmente e mantém a sua atividade anti-proliferativa na linha HCT 116 p53+/+ mesmo após 6 meses de armazenamento a -20ºC, contudo de entre todas as versões testadas esta foi a que mostrou ter um menor efeito citotóxico. A metodologia HIC resultou em 2 amostras diferentes, uma delas enriquecida na fração glicosilada e outra desfavorecida nesta fração, sendo que a primeira possui cerca do dobro da potência da segunda, contudo estas diferenças não são estatisticamente significativas. Em relação à PprFTLHis6 produzida em P. pastoris e purificada por IMAC-Ni, clonada pela primeira vez neste trabalho de modo a facilitar o processo de purificação, verificou-se que o tag His6 não influencia negativamente a atividade anti-proliferativa da frutalina e esta possui um potente efeito anti-proliferativo na linha HCT 116 p53+/+. Curiosamente, as amostras resultantes da metodologia de purificação mais eficiente (SEC) mostraram ter menor efeito anti-proliferativo comparativamente com as amostras resultantes das metodologias menos eficientes (HIC e IMAC-Ni) onde foram obtidas amostras de frutalina recombinante com um potente efeito anti-proliferativo em linhas tumorais humanas HCT 116 p53+/+.
Autores principais:	Gonçalves, Liliana Patrícia Sousa
Assunto:	Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas
Ano:	2014
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	português
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	A frutalina é a principal lectina de sementes da fruta-pão (Artocarpus incisa). Esta lectina é uma glicoproteína tetramérica, parcialmente glicosilada e pertencente à sub-família das lectinas relacionadas com a jacalina com afinidade de ligação a resíduos de D-galactose. Em estudos anteriores a frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris e purificada por cromatografia de exclusão molecular (SEC) mostrou ter um potente efeito citotóxico em células do cancro do cólon do útero (HeLa) e do adenocarcinoma do cólon (HCT 116), sendo este efeito devido à indução de morte celular por apoptose por uma via dependente das caspases e independente da p53. No entanto a purificação por SEC limita a aplicação da frutalina recombinante uma vez que é um processo demorado e resulta em amostras muito diluídas, pelo que metodologias alternativas à sua purificação são necessárias. Por outro lado, a Escherichia coli, como sistema de expressão, permite um processo de produção e purificação mais eficiente contudo as versões resultantes não têm efeito citotóxico. Assim, com o presente trabalho pretendeu-se avaliar o efeito citotóxico de versões de frutalina recombinante produzidas em E. coli, bem como de versões produzidas em P. pastoris e purificadas por diferentes metodologias, nomeadamente cromatografia de exclusão molecular (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia de afinidade ao níquel (IMAC-Ni). Para atingir este objetivo foram testadas duas versões de frutalina produzidas em E. coli, uma delas contendo o tag His6 (EcrHis6FTL) e outra resultante da clivagem do Fh8 da versão EcrFh8FTL (EcrCFTL), em linhas tumorais humanas com (HCT 116 p53+/+) e sem a forma nativa da p53 (HCT 116 p53-/-), e nenhuma destas versões mostrou ter efeito anti-proliferativo em ambas as linhas tumorais. O que sugere que a glicosilação assume um papel importante na atividade da frutalina e a ausência desta resulta na inexistência de atividade anti-proliferativa. Por outro lado, foram produzidas versões de frutalina em P. pastoris, versões glicosiladas, e usadas 3 metodologias de purificação distintas, SEC, HIC e IMAC-Ni. A purificação por HIC e IMAC-Ni não se revelou eficiente contrariamente à purificação por SEC. A frutalina purificada por SEC é estável estruturalmente e mantém a sua atividade anti-proliferativa na linha HCT 116 p53+/+ mesmo após 6 meses de armazenamento a -20ºC, contudo de entre todas as versões testadas esta foi a que mostrou ter um menor efeito citotóxico. A metodologia HIC resultou em 2 amostras diferentes, uma delas enriquecida na fração glicosilada e outra desfavorecida nesta fração, sendo que a primeira possui cerca do dobro da potência da segunda, contudo estas diferenças não são estatisticamente significativas. Em relação à PprFTLHis6 produzida em P. pastoris e purificada por IMAC-Ni, clonada pela primeira vez neste trabalho de modo a facilitar o processo de purificação, verificou-se que o tag His6 não influencia negativamente a atividade anti-proliferativa da frutalina e esta possui um potente efeito anti-proliferativo na linha HCT 116 p53+/+. Curiosamente, as amostras resultantes da metodologia de purificação mais eficiente (SEC) mostraram ter menor efeito anti-proliferativo comparativamente com as amostras resultantes das metodologias menos eficientes (HIC e IMAC-Ni) onde foram obtidas amostras de frutalina recombinante com um potente efeito anti-proliferativo em linhas tumorais humanas HCT 116 p53+/+.