Publicação
Extracellular vesicle-mediated drug delivery in triple negative breast cancer
| Resumo: | O cancro da mama triplo-negativo (CMTN), responsável por 10–15% dos casos de cancro da mama, carece de recetores hormonais chave e depende essencialmente da quimioterapia, cuja eficácia é limitada. O microARN oncogénico miR-155, sobreexpresso em CMTN, promove a progressão tumoral e constitui um alvo promissor para edição genómica. Neste estudo, explorou-se a utilização de exossomas modificados à superfície como veículos do sistema CRISPR-Cas9, com o objetivo de suprimir a expressão de miR-155 nas linhas celulares de CMTN MDA-MB-231 e Hs 578T. Duas construções distintas de CRISPR-Cas9, miR155-sgRNA1 e miR155-sgRNA2, foram transfetadas em células CMTN. A transfecção foi confirmada pela deteção da proteína Cas9, ensaio T7EI e análise de sequenciação de nova geração, que revelaram indels coincidentes com o local de corte esperado. O ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR) confirmou uma redução significativa dos níveis de expressão do miR-155. A análise por western blot demonstrou ativação da via apoptótica intrínseca após a interrupção do miR-155, com o aumento de proteínas pró-apoptóticas e diminuição de proteínas antiapoptóticas nas células transfetadas. Ensaios funcionais mostraram que o knockout do miR-155 reduziu a proliferação e a formação de colónias na linha celular MDA-MB-231, sem afetar significativamente a capacidade de migração celular. Em cultura celular tridimensional (3D), as células transfetadas formaram esferoides menores. O ensaio CAM revelou uma área tumoral significativamente reduzida e uma diminuição do comportamento invasivo para as células transfetadas. Exossomas derivados de células 293T foram caracterizados por NanoSight e DLS, apresentando um tamanho ligeiramente maior e um potencial zeta menos negativo, mas valores de PDI dentro do intervalo esperado. Para otimizar o direcionamento, os exossomas foram conjugados com o péptido 231Pep por pós-inserção, originando um desvio positivo do potencial zeta e um desvio para o azul na fluorescência do triptofano, confirmando a conjugação. Os exossomas modificados, quando adicionados às células MDA-MB-231, não exibiram citotoxicidade e apresentaram uma maior internalização, sugerindo que o 231Pep potencia a captação dos exossomas. No geral, os resultados demonstraram que as construções CRISPR-Cas9 interromperam eficazmente a expressão do miR-155 e modulam o comportamento oncogénico, enquanto os exossomas funcionalizados com 231Pep mostraram ser uma plataforma de entrega eficiente e biocompatível, evidenciando o seu potencial como sistema de entrega terapêutica para CMTN. |
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| Autores principais: | Gandarela, Leonor Batista |
| Assunto: | Cancro da mama CRISPR-Cas9 Exossomas miR-155 Supressão genética Breast cancer Exosomes Gene knockout |
| Ano: | 2025 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | português |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | O cancro da mama triplo-negativo (CMTN), responsável por 10–15% dos casos de cancro da mama, carece de recetores hormonais chave e depende essencialmente da quimioterapia, cuja eficácia é limitada. O microARN oncogénico miR-155, sobreexpresso em CMTN, promove a progressão tumoral e constitui um alvo promissor para edição genómica. Neste estudo, explorou-se a utilização de exossomas modificados à superfície como veículos do sistema CRISPR-Cas9, com o objetivo de suprimir a expressão de miR-155 nas linhas celulares de CMTN MDA-MB-231 e Hs 578T. Duas construções distintas de CRISPR-Cas9, miR155-sgRNA1 e miR155-sgRNA2, foram transfetadas em células CMTN. A transfecção foi confirmada pela deteção da proteína Cas9, ensaio T7EI e análise de sequenciação de nova geração, que revelaram indels coincidentes com o local de corte esperado. O ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR) confirmou uma redução significativa dos níveis de expressão do miR-155. A análise por western blot demonstrou ativação da via apoptótica intrínseca após a interrupção do miR-155, com o aumento de proteínas pró-apoptóticas e diminuição de proteínas antiapoptóticas nas células transfetadas. Ensaios funcionais mostraram que o knockout do miR-155 reduziu a proliferação e a formação de colónias na linha celular MDA-MB-231, sem afetar significativamente a capacidade de migração celular. Em cultura celular tridimensional (3D), as células transfetadas formaram esferoides menores. O ensaio CAM revelou uma área tumoral significativamente reduzida e uma diminuição do comportamento invasivo para as células transfetadas. Exossomas derivados de células 293T foram caracterizados por NanoSight e DLS, apresentando um tamanho ligeiramente maior e um potencial zeta menos negativo, mas valores de PDI dentro do intervalo esperado. Para otimizar o direcionamento, os exossomas foram conjugados com o péptido 231Pep por pós-inserção, originando um desvio positivo do potencial zeta e um desvio para o azul na fluorescência do triptofano, confirmando a conjugação. Os exossomas modificados, quando adicionados às células MDA-MB-231, não exibiram citotoxicidade e apresentaram uma maior internalização, sugerindo que o 231Pep potencia a captação dos exossomas. No geral, os resultados demonstraram que as construções CRISPR-Cas9 interromperam eficazmente a expressão do miR-155 e modulam o comportamento oncogénico, enquanto os exossomas funcionalizados com 231Pep mostraram ser uma plataforma de entrega eficiente e biocompatível, evidenciando o seu potencial como sistema de entrega terapêutica para CMTN. |
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