Publicação
Cell-derived extracellular vesicles as a delivery platform towards triple negative breast cancer
| Resumo: | O cancro da mama triplo negativo (CMTN) representa cerca de 10 – 20 % dos casos de cancro da mama e está associado a baixas taxas de sobrevivência e mau prognóstico clínico. Por conseguinte, é crucial explorar novas terapias direcionadas. O microRNA 155 (miR-155), regulado positivamente no CMTN, desempenha um papel chave na progressão do tumor. Esta dissertação explora o uso de exossomas para a entrega de um sistema CRISPR/Cas9 com o objetivo de interromper a expressão do miR-155 na linha celular MDA-MB-231 de CMTN. Duas construções distintas de CRISPR/Cas9, miR155-sgRNA1 e miR155-sgRNA2, foram transfetadas para as células MDA-MB-231. O ensaio T7EI confirmou a presença de indels no DNA genómico das células transfetadas, validando a atividade do sistema CRISPR/Cas9. Os ensaios in vitro realizados mostraram que a presença das construções diminuiu a proliferação celular, a capacidade de formação de colónias, a taxa de recuperação de feridas e alteraram o ciclo celular. O efeito foi também testado em cultura celular tridimensional (3D), onde não foram observados efeitos significativos. Exossomas foram extraídos de células HEK293T e a sua caracterização foi realizada através de NanoSight, DLS, Cryo-EM e Western blot. Para encapsular as construções de CRISPR/Cas9, eletroporação e incubação foram realizadas. Os exossomas eletroporados mostraram alterações no potencial zeta e índice de polidispersidade, mas não no tamanho, o que sugere maior estabilidade, mas maior polidespersidade. Posteriormente, os exossomas carregados com ambas as construções (por eletroporação e incubação) foram adicionados às células MDA MB-231. No entanto, apenas a eletroporação resultou numa diminuição significativa da viabilidade celular. Em contraste, o mesmo não foi observado na cultura celular 3D, onde a inserção das construções encapsuladas via eletroporação não evidenciou efeito na viabilidade celular. Os nossos resultados mostraram que a presença das construções de CRISPR/Cas9 afetou o desenvolvimento normal das células MDA-MB-231 e a entrega mediada por exossomas das construções CRISPR/Cas9 provou ser uma estratégia promissora para o knockout do miR-155 em cultura celular a duas dimensões (2D) de CMTN. |
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| Autores principais: | Gonçalves, Catarina Augusta Silva |
| Assunto: | Cancro da mama MDA-MB-231 Exossomas CRISPR/Cas9 sgRNA Entrega Breast cancer Exosomes Delivery |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | O cancro da mama triplo negativo (CMTN) representa cerca de 10 – 20 % dos casos de cancro da mama e está associado a baixas taxas de sobrevivência e mau prognóstico clínico. Por conseguinte, é crucial explorar novas terapias direcionadas. O microRNA 155 (miR-155), regulado positivamente no CMTN, desempenha um papel chave na progressão do tumor. Esta dissertação explora o uso de exossomas para a entrega de um sistema CRISPR/Cas9 com o objetivo de interromper a expressão do miR-155 na linha celular MDA-MB-231 de CMTN. Duas construções distintas de CRISPR/Cas9, miR155-sgRNA1 e miR155-sgRNA2, foram transfetadas para as células MDA-MB-231. O ensaio T7EI confirmou a presença de indels no DNA genómico das células transfetadas, validando a atividade do sistema CRISPR/Cas9. Os ensaios in vitro realizados mostraram que a presença das construções diminuiu a proliferação celular, a capacidade de formação de colónias, a taxa de recuperação de feridas e alteraram o ciclo celular. O efeito foi também testado em cultura celular tridimensional (3D), onde não foram observados efeitos significativos. Exossomas foram extraídos de células HEK293T e a sua caracterização foi realizada através de NanoSight, DLS, Cryo-EM e Western blot. Para encapsular as construções de CRISPR/Cas9, eletroporação e incubação foram realizadas. Os exossomas eletroporados mostraram alterações no potencial zeta e índice de polidispersidade, mas não no tamanho, o que sugere maior estabilidade, mas maior polidespersidade. Posteriormente, os exossomas carregados com ambas as construções (por eletroporação e incubação) foram adicionados às células MDA MB-231. No entanto, apenas a eletroporação resultou numa diminuição significativa da viabilidade celular. Em contraste, o mesmo não foi observado na cultura celular 3D, onde a inserção das construções encapsuladas via eletroporação não evidenciou efeito na viabilidade celular. Os nossos resultados mostraram que a presença das construções de CRISPR/Cas9 afetou o desenvolvimento normal das células MDA-MB-231 e a entrega mediada por exossomas das construções CRISPR/Cas9 provou ser uma estratégia promissora para o knockout do miR-155 em cultura celular a duas dimensões (2D) de CMTN. |
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