Publicação

Biotic stress in grapevine – elucidation of the role of the newly identified SWEET transporters on plant-pathogen interaction

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os açúcares desempenham funções vitais nos seres vivos, principalmente como fontes de carbono e de energia, mas também como reguladores osmóticos e como moléculas sinalizadoras. Em particular, na videira (Vitis vinífera L.), a qualidade do vinho depende dos níveis de açúcar nos bagos de uva porque determinam a concentração em etanol e influenciam a síntese de compostos secundários (incluindo pigmentos). Diferentes famílias de transportadores membranares presentes no genoma das plantas desempenham um papel essencial na translocação de açúcares entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Entre eles, os transportadores denominados SWEET (Sugars Will Eventually be Exported Transporter), recentemente identificados, têm revelado diferentes papéis em mecanismos fisiológicos onde o efluxo de açúcar é fundamental, como nos nectários. Na videira, a família SWEET compreende 17 membros. No presente estudo pretendeu-se elucidar o papel dos VvSWEETs na resposta da videira à infeção por fungos (Botrytis cinerea e Erysiphe necator) e ao stresse abiótico, incluindo a secura. Além disso, para estudar os papéis fisiológicos do VvSWEET7 e VvSWEET15, foram aplicadas diferentes técnicas de engenharia genética de plantas, tal como CRISPR-Cas9. Em particular, na variedade Trincadeira, susceptível ao fungo B. cinerea, e na variedade Carignan, susceptível a E. necator, foram analisadas em detalhe as modificações no perfil de expressão dos SWEETs em bagos de uva infetados. Os resultados mostraram que a infeção por E. necator causa modificações mais pronunciadas na expressão dos VvSWEETs do que a infecção por Botrytis. Por outro lado, a maioria dos SWEETs da videira foram regulados negativamente em bagos de uva em resposta à secura, no entanto, o VvSWEET10 e VvSWEET11 foram regulados positivamente. Foi também observado que a expressão do VvSWEET1, VvSWEET4 e VvSWEET11 é regulada positivamente em folhas tratadas com caulino (filme inerte usado para proteger as videiras em situações de deficit hídrico, de radiação solar extrema e de ondas de calor), sugerindo que este mineral estimula a capacidade de transporte de sacarose entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Estudos subsequentes mostraram que os genes VvSWEET11 e VvSWEET15 são positivamente regulados em bagos de uva submetidos a temperaturas de 50ºC durante 7 dias, tratamento normalmente usado para a produção de uvas passas. Uma vez que os níveis de transcritos dos genes VvSWEET7 e VvSWEET15 foram elevados nos bagos de uva e aumentaram em resposta à infeção por Botrytis, as proteínas VvSWEET7 e VvSWEET15 foram alvo de estudos adicionais para se avaliar a sua localização sub-celular e função. As proteínas de fusão VvSWEET7-GFP e VvSWEET15- GFP foram transitoriamente expressas em células da epiderme de Nicotiana benthamiana e os resultados de microscopia confocal mostraram que ambas as proteínas se localizam claramente na membrana plasmática. Após expressão heteróloga numa estirpe mutante de Saccharomyces cerevisiae (hxt-null), a proteína VvSWEET7 foi caracterizada funcionalmente como um transportador de glucose e de sacarose (Km =15,4 mM glucose e Km = 40,1 mM sacarose). Ensaios de inibição competitiva mostraram que o manitol e o sorbitol inibem o transporte de D-[14C(U)]- glucose, sugerindo que, além de mono- e de dissacarídeos, o VvSWEET7 medeia o transporte de polióis. No presente trabalho foram ainda identificados no genoma da videira 18 membros da família de transportadores de açúcares denominada ERD6like e a proteína VvERD6l13 foi alvo de um estudo mais aprofundado. A proteína de fusão VvERD6l13-GFP foi transitoriamente expressa em folhas de N. benthamiana após transformação mediada por Agrobacterium e os resultados de microscopia de fluorescência mostraram que se localiza na membrana plasmática. Estudos de transporte de açúcares marcados radioativamente, após expressão heteróloga em leveduras mutantes (hxt-null), mostraram que a proteína VvERD6l13 é um transportador de sacarose com protões (Km = 33 mM). O gene VvERD6l13 é fortemente regulado em bagos de uva infetados com Botrytis ou E. necator, sugerindo que a proteína VvERD6l13 tem um papel importante durante a interação planta-patógeno. Além disso, o VvERD6l13 é expresso em diferentes tecidos da videira, em particular na raiz. Genericamente, os resultados mostraram que os transportadores VvSWEET e o VvERD6l desempenham um papel importante na mobilização de açúcares durante o desenvolvimento dos bagos de uva e que a sua expressão é regulada ao nível da transcrição em resposta ao stresse biótico e abiótico. No seu conjunto, estes resultados ajudam a compor o puzzle complexo dos mecanismos de resposta da videira aos stresses biótico e abiótico, abrindo ainda caminhos novos e desafiadores no tópico do transporte transmembranar em plantas.
Autores principais:	Breia, Richard Maykel Gonçalves
Assunto:	Bago da uva Botrytis cinerea Oídio: Stresse biótico Transportadores de açúcares Biotic stress Botrytis cinerea Grape berry Grey mould Sugar transporters
Ano:	2020
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	português
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	Os açúcares desempenham funções vitais nos seres vivos, principalmente como fontes de carbono e de energia, mas também como reguladores osmóticos e como moléculas sinalizadoras. Em particular, na videira (Vitis vinífera L.), a qualidade do vinho depende dos níveis de açúcar nos bagos de uva porque determinam a concentração em etanol e influenciam a síntese de compostos secundários (incluindo pigmentos). Diferentes famílias de transportadores membranares presentes no genoma das plantas desempenham um papel essencial na translocação de açúcares entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Entre eles, os transportadores denominados SWEET (Sugars Will Eventually be Exported Transporter), recentemente identificados, têm revelado diferentes papéis em mecanismos fisiológicos onde o efluxo de açúcar é fundamental, como nos nectários. Na videira, a família SWEET compreende 17 membros. No presente estudo pretendeu-se elucidar o papel dos VvSWEETs na resposta da videira à infeção por fungos (Botrytis cinerea e Erysiphe necator) e ao stresse abiótico, incluindo a secura. Além disso, para estudar os papéis fisiológicos do VvSWEET7 e VvSWEET15, foram aplicadas diferentes técnicas de engenharia genética de plantas, tal como CRISPR-Cas9. Em particular, na variedade Trincadeira, susceptível ao fungo B. cinerea, e na variedade Carignan, susceptível a E. necator, foram analisadas em detalhe as modificações no perfil de expressão dos SWEETs em bagos de uva infetados. Os resultados mostraram que a infeção por E. necator causa modificações mais pronunciadas na expressão dos VvSWEETs do que a infecção por Botrytis. Por outro lado, a maioria dos SWEETs da videira foram regulados negativamente em bagos de uva em resposta à secura, no entanto, o VvSWEET10 e VvSWEET11 foram regulados positivamente. Foi também observado que a expressão do VvSWEET1, VvSWEET4 e VvSWEET11 é regulada positivamente em folhas tratadas com caulino (filme inerte usado para proteger as videiras em situações de deficit hídrico, de radiação solar extrema e de ondas de calor), sugerindo que este mineral estimula a capacidade de transporte de sacarose entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Estudos subsequentes mostraram que os genes VvSWEET11 e VvSWEET15 são positivamente regulados em bagos de uva submetidos a temperaturas de 50ºC durante 7 dias, tratamento normalmente usado para a produção de uvas passas. Uma vez que os níveis de transcritos dos genes VvSWEET7 e VvSWEET15 foram elevados nos bagos de uva e aumentaram em resposta à infeção por Botrytis, as proteínas VvSWEET7 e VvSWEET15 foram alvo de estudos adicionais para se avaliar a sua localização sub-celular e função. As proteínas de fusão VvSWEET7-GFP e VvSWEET15- GFP foram transitoriamente expressas em células da epiderme de Nicotiana benthamiana e os resultados de microscopia confocal mostraram que ambas as proteínas se localizam claramente na membrana plasmática. Após expressão heteróloga numa estirpe mutante de Saccharomyces cerevisiae (hxt-null), a proteína VvSWEET7 foi caracterizada funcionalmente como um transportador de glucose e de sacarose (Km =15,4 mM glucose e Km = 40,1 mM sacarose). Ensaios de inibição competitiva mostraram que o manitol e o sorbitol inibem o transporte de D-[14C(U)]- glucose, sugerindo que, além de mono- e de dissacarídeos, o VvSWEET7 medeia o transporte de polióis. No presente trabalho foram ainda identificados no genoma da videira 18 membros da família de transportadores de açúcares denominada ERD6like e a proteína VvERD6l13 foi alvo de um estudo mais aprofundado. A proteína de fusão VvERD6l13-GFP foi transitoriamente expressa em folhas de N. benthamiana após transformação mediada por Agrobacterium e os resultados de microscopia de fluorescência mostraram que se localiza na membrana plasmática. Estudos de transporte de açúcares marcados radioativamente, após expressão heteróloga em leveduras mutantes (hxt-null), mostraram que a proteína VvERD6l13 é um transportador de sacarose com protões (Km = 33 mM). O gene VvERD6l13 é fortemente regulado em bagos de uva infetados com Botrytis ou E. necator, sugerindo que a proteína VvERD6l13 tem um papel importante durante a interação planta-patógeno. Além disso, o VvERD6l13 é expresso em diferentes tecidos da videira, em particular na raiz. Genericamente, os resultados mostraram que os transportadores VvSWEET e o VvERD6l desempenham um papel importante na mobilização de açúcares durante o desenvolvimento dos bagos de uva e que a sua expressão é regulada ao nível da transcrição em resposta ao stresse biótico e abiótico. No seu conjunto, estes resultados ajudam a compor o puzzle complexo dos mecanismos de resposta da videira aos stresses biótico e abiótico, abrindo ainda caminhos novos e desafiadores no tópico do transporte transmembranar em plantas.