Publicação

Development of an improved diagnosis of K. pneumoniae based on specific viral proteins

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Klebsiella pneumoniae é uma espécie com relevância clínica incluída na lista de bactérias prioritárias que apresentam resistência a antibióticos e para as quais são necessários novos antimicrobianos. Além disso, esta bactéria é responsável por uma parte considerável das infeções associadas a cuidados de saúde. Nesse sentido, torna-se ainda mais crítico detetar e identificar de forma eficaz, rápida e precisa, possibilitando a administração do tratamento adequado o mais rapidamente possível. Contudo, os métodos atualmente disponíveis são, em geral, trabalhosos, demorados e carecem de especificidade e sensibilidade, comprometendo o tratamento rápido e eficaz da infeção. As proteínas de ligação a receptores (“Receptor-binding proteins” - RBPs) dos bacterió(fagos), proteínas responsáveis pelo reconhecimento e ligação dos fagos aos recetores das suas bactérias hospedeiras, apresentam elevado potencial como elementos de biorreconhecimento em ferramentas de diagnóstico, nomeadamente biossensores que demonstram uma capacidade melhorada na deteção e identificação de bactérias, superando as desvantagens dos métodos atuais. O objetivo principal do trabalho foi identificar e estudar RBPs de fagos de Klebsiella capazes de identificar estirpes de K. pneumoniae com alta especificidade e sensibilidade para serem utilizadas como elementos de biorreconhecimento. Além disso, tendo em conta o curto espetro dos fagos de Klebsiella e, consequentemente, das suas RBPs, também se pretendeu fundir entre si duas RBPs com espetros de ação complementares com o objetivo de originar uma molécula com maior sensibilidade, combinando o espetro de ligação das duas RBPs. Para tal, pretendeu-se utilizar uma nova RBP identificada neste trabalho e outra, anteriormente caraterizada pelo grupo, a gp86 do fago KpnM6E1 que demonstrou elevada especificidade no reconhecimento de K. pneumoniae. Utilizando ferramentas de bioinformática, foi possível identificar sete putativas RBPs do fago 8E2-F1. Os genes que codificam as putativas RBPs foram inseridas no plasmídeo pET28a contendo uma proteína verde fluorescente e clonados em E. coli para expressão das proteínas recombinantes. Por microscopia de fluorescência, verificou-se que nenhuma das proteínas do fago 8E2-F1 selecionadas demonstrou capacidade de reconhecer e se ligar às estirpes Kp122 e Kp123 (infetadas pelo fago). Este resultado pode surgir de uma falha na apresentação da conformação biológica regular, afetando sua funcionalidade. Quanto à gp86 do fago KpnM6E1 previamente caracterizada pelo grupo, também foi considerada uma versão truncada da proteína. As duas proteínas demonstraram que podiam reconhecer e identificar estirpes de K. pneumoniae. Durante este estudo, foi identificada uma proteína fágica depolimerase que pode apresentar alto potencial no tratamento de K. pneumoniae.
Autores principais:	Rocha, Silvério Daniel Morais da
Assunto:	Klebsiella pneumoniae Métodos de deteção Bacteriófagos RBP Detection methods Bacteriophages
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	inglês
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	Klebsiella pneumoniae é uma espécie com relevância clínica incluída na lista de bactérias prioritárias que apresentam resistência a antibióticos e para as quais são necessários novos antimicrobianos. Além disso, esta bactéria é responsável por uma parte considerável das infeções associadas a cuidados de saúde. Nesse sentido, torna-se ainda mais crítico detetar e identificar de forma eficaz, rápida e precisa, possibilitando a administração do tratamento adequado o mais rapidamente possível. Contudo, os métodos atualmente disponíveis são, em geral, trabalhosos, demorados e carecem de especificidade e sensibilidade, comprometendo o tratamento rápido e eficaz da infeção. As proteínas de ligação a receptores (“Receptor-binding proteins” - RBPs) dos bacterió(fagos), proteínas responsáveis pelo reconhecimento e ligação dos fagos aos recetores das suas bactérias hospedeiras, apresentam elevado potencial como elementos de biorreconhecimento em ferramentas de diagnóstico, nomeadamente biossensores que demonstram uma capacidade melhorada na deteção e identificação de bactérias, superando as desvantagens dos métodos atuais. O objetivo principal do trabalho foi identificar e estudar RBPs de fagos de Klebsiella capazes de identificar estirpes de K. pneumoniae com alta especificidade e sensibilidade para serem utilizadas como elementos de biorreconhecimento. Além disso, tendo em conta o curto espetro dos fagos de Klebsiella e, consequentemente, das suas RBPs, também se pretendeu fundir entre si duas RBPs com espetros de ação complementares com o objetivo de originar uma molécula com maior sensibilidade, combinando o espetro de ligação das duas RBPs. Para tal, pretendeu-se utilizar uma nova RBP identificada neste trabalho e outra, anteriormente caraterizada pelo grupo, a gp86 do fago KpnM6E1 que demonstrou elevada especificidade no reconhecimento de K. pneumoniae. Utilizando ferramentas de bioinformática, foi possível identificar sete putativas RBPs do fago 8E2-F1. Os genes que codificam as putativas RBPs foram inseridas no plasmídeo pET28a contendo uma proteína verde fluorescente e clonados em E. coli para expressão das proteínas recombinantes. Por microscopia de fluorescência, verificou-se que nenhuma das proteínas do fago 8E2-F1 selecionadas demonstrou capacidade de reconhecer e se ligar às estirpes Kp122 e Kp123 (infetadas pelo fago). Este resultado pode surgir de uma falha na apresentação da conformação biológica regular, afetando sua funcionalidade. Quanto à gp86 do fago KpnM6E1 previamente caracterizada pelo grupo, também foi considerada uma versão truncada da proteína. As duas proteínas demonstraram que podiam reconhecer e identificar estirpes de K. pneumoniae. Durante este estudo, foi identificada uma proteína fágica depolimerase que pode apresentar alto potencial no tratamento de K. pneumoniae.