Publicação
Real-time imaging of cell mineralization
| Resumo: | A calcificação ectópica tem-se revelado um problema emergente na área da saúde devido à sua correlação com várias doenças, como a doença renal crónica (DRC), hipertensão, diabetes mellitus (DM), doença cardiovascular aterotrombótica e envelhecimento. Este tipo de calcificação está associado principalmente à deposição anormal de complexos de sais de cálcio e fosfato– hidroxiapatite – em células do músculo liso nos vasos sanguíneos. Estudos atuais têm revelado o papel de proteínas plasmáticas que poderão inibir a calcificação tal como a fetuína-A. A presente dissertação visa estudar o papel da proteína plasmática – Fetuína-A – na calcificação ectópica, utilizando o dispositivo de aquisição de imagens em tempo real –CELLCYTE – para seguir e avaliar a sequência de eventos biológicos e a cinética celular. Desta forma, uma variante recombinante de fetuína-A com propriedade de fluorescência, mFa-mRuby, foi produzida e estudada, uma vez que esta proteína é caracterizada por se ligar a depósitos minerais intrínsecos da calcificação ectópica. Protocolos como expressão proteica em células de ovário de hamster chinês (CHO), purificação, transfecção de alto rendimento, Western Dot Blot e SDS-PAGE foram realizados para produzir as amostras de fetuína-A em estudo. Para mimetizar a calcificação patológica no corpo humano, cultura de duas linhas celulares de células do músculo liso vasculares (VSMC) – IM1 e IM3 - foram cultivadas assim como células de osteossarcoma (SaOs-2) e cementoblastos (OCCM), para mimetizar mineralização fisiológica. Todas as linhas celulares foram incubadas em meio de cultura ou de calcificação, para avaliar a proliferação celular e a mineralização ao longo de 7 dias, com ou sem adição de fetuína-A ao meio. Os depósitos minerais foram revelados utilizando o protocolo de coloração de fetuína-A e posterior coloração Alizarin Red. Os resultados observados revelaram uma maior taxa de calcificação das VSMC em comparação com os mineralizadores profissionais (SaOs-2 e OCCM) e uma ligeira inibição da calcificação e mineralização das quatro linhas celulares com adição de fetuína-A em ambos os meios de cultura. Em suma o presente trabalho, proporcionou uma base robusta para pesquisas aprofundadas sobre a calcificação ectópica e o papel da fetuína-A, assim como expandir as aplicações médicas desta proteína plasmática promissora. |
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| Autores principais: | Silva, Eduarda Margarida Alves |
| Assunto: | Calcificação ectópica CELLCYTE Fetuína-A SDS-PAGE VSMC Ectopic calcification Fetuin-A Ciências Médicas::Biotecnologia Médica |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | A calcificação ectópica tem-se revelado um problema emergente na área da saúde devido à sua correlação com várias doenças, como a doença renal crónica (DRC), hipertensão, diabetes mellitus (DM), doença cardiovascular aterotrombótica e envelhecimento. Este tipo de calcificação está associado principalmente à deposição anormal de complexos de sais de cálcio e fosfato– hidroxiapatite – em células do músculo liso nos vasos sanguíneos. Estudos atuais têm revelado o papel de proteínas plasmáticas que poderão inibir a calcificação tal como a fetuína-A. A presente dissertação visa estudar o papel da proteína plasmática – Fetuína-A – na calcificação ectópica, utilizando o dispositivo de aquisição de imagens em tempo real –CELLCYTE – para seguir e avaliar a sequência de eventos biológicos e a cinética celular. Desta forma, uma variante recombinante de fetuína-A com propriedade de fluorescência, mFa-mRuby, foi produzida e estudada, uma vez que esta proteína é caracterizada por se ligar a depósitos minerais intrínsecos da calcificação ectópica. Protocolos como expressão proteica em células de ovário de hamster chinês (CHO), purificação, transfecção de alto rendimento, Western Dot Blot e SDS-PAGE foram realizados para produzir as amostras de fetuína-A em estudo. Para mimetizar a calcificação patológica no corpo humano, cultura de duas linhas celulares de células do músculo liso vasculares (VSMC) – IM1 e IM3 - foram cultivadas assim como células de osteossarcoma (SaOs-2) e cementoblastos (OCCM), para mimetizar mineralização fisiológica. Todas as linhas celulares foram incubadas em meio de cultura ou de calcificação, para avaliar a proliferação celular e a mineralização ao longo de 7 dias, com ou sem adição de fetuína-A ao meio. Os depósitos minerais foram revelados utilizando o protocolo de coloração de fetuína-A e posterior coloração Alizarin Red. Os resultados observados revelaram uma maior taxa de calcificação das VSMC em comparação com os mineralizadores profissionais (SaOs-2 e OCCM) e uma ligeira inibição da calcificação e mineralização das quatro linhas celulares com adição de fetuína-A em ambos os meios de cultura. Em suma o presente trabalho, proporcionou uma base robusta para pesquisas aprofundadas sobre a calcificação ectópica e o papel da fetuína-A, assim como expandir as aplicações médicas desta proteína plasmática promissora. |
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