Publicação

Development of a scalable bioprocess for large-scale production of a recombinant protein for the cosmetic industry

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os avanços biotecnológicos têm aberto novas possibilidades para a produção sustentável de compostos bioativos, como proteínas e péptidos, com aplicações em formulações cosméticas. A levedura Pichia pastoris tem-se destacado como um sistema de expressão robusto e eficiente, especialmente quando controlado pelo promotor AOX1, que é induzido por metanol. No entanto, a otimização de estirpes, condições de fermentação e estratégias de purificação é fundamental para maximizar os rendimentos de proteínas recombinantes. Este estudo focou-se no desenvolvimento de um bioprocesso para a produção de uma proteína recombinante em P. pastoris, utilizando quatro variantes com diferentes sequências do fator-α de acasalamento: αMF (fator-α completo), ΔαMF (fator-α truncado com deleção em Δ57–70), Ost1-αMF (região pré do fator-α substituída pelo sinal Ost1 de Saccharomyces cerevisiae) e Epx1-αMF (região pré substituída pelo sinal Epx1 de P. pastoris). Estas variantes foram projetadas para explorar diferentes eficácias de secreção e estabilidade da proteína de interesse durante a produção. Os rastreios iniciais em meio BMMY permitiram identificar a variante ΔαMF como a mais promissora na produção da proteína recombinante, apresentando maiores níveis de expressão. Posteriormente, a otimização em frascos de cultura demonstrou que a redução da temperatura de indução de 28 para 22 °C aumentou significativamente a expressão da proteína na variante ΔαMF3. Para a purificação, recorreu-se a esferas magnéticas de níquel, visando aproveitar a cauda de poli histidina presente na proteína para um processo de purificação baseado na afinidade. No entanto, esta abordagem não atingiu o nível de pureza desejado, provavelmente devido à baixa acessibilidade da cauda. Tentou-se também o uso do Ciclo de Transição Inversa (ITC), mas esta abordagem foi ineficaz para purificação, devido à elevada temperatura de transição necessária para a proteína, que possui uma superfície altamente carregada. Uma purificação parcial da proteína foi finalmente alcançada através da acidificação dos sobrenadantes. Apesar disso, novos passos de purificação serão necessários para atingir a pureza completa da proteína, essencial para a aplicação cosmética. Na ampliação do processo, foram realizados ensaios de fermentação em biorreatores com diferentes concentrações de glicerol. Observou se que a concentração de 4 % (v/v) de glicerol resultou num crescimento celular superior e um rendimento proteico mais elevado em comparação com 1 % (v/v). Estes resultados demonstraram o potencial do processo desenvolvido para a produção em larga escala de proteínas recombinantes para aplicações inovadoras na indústria cosmética.
Autores principais:	Costa, Aurora Gabriela Fernandes Ferreira
Assunto:	Bioprocesso Expressão proteica Indústria cosmética Pichia pastoris Promotor AOX1 AOX1 promoter Bioprocess Cosmetic industry Protein expression
Ano:	2024
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade do Minho
Idioma:	inglês
Origem:	RepositóriUM - Universidade do Minho

Descrição
Resumo:	Os avanços biotecnológicos têm aberto novas possibilidades para a produção sustentável de compostos bioativos, como proteínas e péptidos, com aplicações em formulações cosméticas. A levedura Pichia pastoris tem-se destacado como um sistema de expressão robusto e eficiente, especialmente quando controlado pelo promotor AOX1, que é induzido por metanol. No entanto, a otimização de estirpes, condições de fermentação e estratégias de purificação é fundamental para maximizar os rendimentos de proteínas recombinantes. Este estudo focou-se no desenvolvimento de um bioprocesso para a produção de uma proteína recombinante em P. pastoris, utilizando quatro variantes com diferentes sequências do fator-α de acasalamento: αMF (fator-α completo), ΔαMF (fator-α truncado com deleção em Δ57–70), Ost1-αMF (região pré do fator-α substituída pelo sinal Ost1 de Saccharomyces cerevisiae) e Epx1-αMF (região pré substituída pelo sinal Epx1 de P. pastoris). Estas variantes foram projetadas para explorar diferentes eficácias de secreção e estabilidade da proteína de interesse durante a produção. Os rastreios iniciais em meio BMMY permitiram identificar a variante ΔαMF como a mais promissora na produção da proteína recombinante, apresentando maiores níveis de expressão. Posteriormente, a otimização em frascos de cultura demonstrou que a redução da temperatura de indução de 28 para 22 °C aumentou significativamente a expressão da proteína na variante ΔαMF3. Para a purificação, recorreu-se a esferas magnéticas de níquel, visando aproveitar a cauda de poli histidina presente na proteína para um processo de purificação baseado na afinidade. No entanto, esta abordagem não atingiu o nível de pureza desejado, provavelmente devido à baixa acessibilidade da cauda. Tentou-se também o uso do Ciclo de Transição Inversa (ITC), mas esta abordagem foi ineficaz para purificação, devido à elevada temperatura de transição necessária para a proteína, que possui uma superfície altamente carregada. Uma purificação parcial da proteína foi finalmente alcançada através da acidificação dos sobrenadantes. Apesar disso, novos passos de purificação serão necessários para atingir a pureza completa da proteína, essencial para a aplicação cosmética. Na ampliação do processo, foram realizados ensaios de fermentação em biorreatores com diferentes concentrações de glicerol. Observou se que a concentração de 4 % (v/v) de glicerol resultou num crescimento celular superior e um rendimento proteico mais elevado em comparação com 1 % (v/v). Estes resultados demonstraram o potencial do processo desenvolvido para a produção em larga escala de proteínas recombinantes para aplicações inovadoras na indústria cosmética.