Publicação
Characterization and engineering of sugar transporters in the yeast Kluyveromyces marxianus for biotechnological applications
| Resumo: | A utilização sustentável e eficiente de hidrolisados lignocelulósicos por leveduras em biorefinarias, requer o consumo simultâneo de todos os açúcares presentes nesta matéria-prima, nomeadamente, hexoses e pentoses. Este aspeto está, no entanto, limitado pelo baixo número de transportadores específicos para pentoses conhecidos e pela reduzida taxa de consumo de pentoses pela levedura quando a glucose está presente. Kluyveromyces marxianus é uma levedura não convencional que tem atraído atenção considerável devido às suas características com grande interesse industrial, como a capacidade de assimilação natural de pentoses, elevadas termotolerância e taxa de crescimento. Neste contexto, o principal objetivo da presente tese foi estudar o transporte de pentoses em K. marxianus, de forma a selecionar e modificar um transportador que permitisse o co-consumo de glucose e xilose para a aplicação em biorefinarias. A fim de identificar novos transportadores de pentoses, foi criada uma estirpe de K. marxianus, na qual foram eliminados 12 genes que codificavam transportadores da superfamíia MFS (major facilitator superfamily) e que não apresentava crescimento em pentoses (xilose ou arabinose). Usando esta plataforma ΔPT, identificamos vários transportadores de K. marxianus que recuperaram a capacidade da estirpe utilizar xilose e/ou arabinose. Estes transportadores foram caracterizados quanto à cinética de transporte de pentose e glucose utilizando açúcares marcados com 14C. Um destes transportadores mostrou uma alta afinidade tanto para a xilose como para a glucose, embora a afinidade para a glucose ainda fosse 150 vezes maior do que para a xilose. Usando em análise in silico foram selecionamos aminoácidos-alvo deste transportador para mutagénese dirigida, numa tentativa de aumentar a afinidade para a xilose e diminuir o transporte de glucose. Vários mutantes foram construídos e caracterizados por ensaios radioativos e por avaliação do seu crescimento em misturas de açúcares. Um destes mutantes apresentou uma afinidade mais reduzida para glucose aumentando, simultaneamente a sua afinidade para a xilose, mostrando-se muito promissor. A reprogramação bem sucedida deste transportador foi usada para facilitar o co-consumo eficiente de hexoses e pentoses numa nova estirpe de K. marxianus, encurtando significativamente o tempo de fermentação em bioreatores com misturas destes açúcares. |
|---|---|
| Autores principais: | Donzella, Lorena |
| Assunto: | Levedura Transportadores de açúcares Xilose Biorefinarias Kluyveromyces spp. Yeast Sugar transporters Biorefineries |
| Ano: | 2022 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | A utilização sustentável e eficiente de hidrolisados lignocelulósicos por leveduras em biorefinarias, requer o consumo simultâneo de todos os açúcares presentes nesta matéria-prima, nomeadamente, hexoses e pentoses. Este aspeto está, no entanto, limitado pelo baixo número de transportadores específicos para pentoses conhecidos e pela reduzida taxa de consumo de pentoses pela levedura quando a glucose está presente. Kluyveromyces marxianus é uma levedura não convencional que tem atraído atenção considerável devido às suas características com grande interesse industrial, como a capacidade de assimilação natural de pentoses, elevadas termotolerância e taxa de crescimento. Neste contexto, o principal objetivo da presente tese foi estudar o transporte de pentoses em K. marxianus, de forma a selecionar e modificar um transportador que permitisse o co-consumo de glucose e xilose para a aplicação em biorefinarias. A fim de identificar novos transportadores de pentoses, foi criada uma estirpe de K. marxianus, na qual foram eliminados 12 genes que codificavam transportadores da superfamíia MFS (major facilitator superfamily) e que não apresentava crescimento em pentoses (xilose ou arabinose). Usando esta plataforma ΔPT, identificamos vários transportadores de K. marxianus que recuperaram a capacidade da estirpe utilizar xilose e/ou arabinose. Estes transportadores foram caracterizados quanto à cinética de transporte de pentose e glucose utilizando açúcares marcados com 14C. Um destes transportadores mostrou uma alta afinidade tanto para a xilose como para a glucose, embora a afinidade para a glucose ainda fosse 150 vezes maior do que para a xilose. Usando em análise in silico foram selecionamos aminoácidos-alvo deste transportador para mutagénese dirigida, numa tentativa de aumentar a afinidade para a xilose e diminuir o transporte de glucose. Vários mutantes foram construídos e caracterizados por ensaios radioativos e por avaliação do seu crescimento em misturas de açúcares. Um destes mutantes apresentou uma afinidade mais reduzida para glucose aumentando, simultaneamente a sua afinidade para a xilose, mostrando-se muito promissor. A reprogramação bem sucedida deste transportador foi usada para facilitar o co-consumo eficiente de hexoses e pentoses numa nova estirpe de K. marxianus, encurtando significativamente o tempo de fermentação em bioreatores com misturas destes açúcares. |
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