Publicação

Identification of proteases as diagnostic and drug targets in bovine babesiosis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A babesiose bovina é uma doença transmitida por carraças, que causa elevada morbidade e mortalidade, e provoca consideráveis perdas económicas devido aos esforços para controlar esta doença. As medidas de controlo da babesiose bovina incluem a erradicação ou redução de carraças, correcto diagnóstico, assim como tratamento e vacinação apropriados. Este trabalho tem como objectivo contribuir para um melhor diagnóstico da infecção e a consequente melhoria de algumas das medidas de controlo, bem como identificar e caracterizar genes de proteases utilizados para o desenvolvimento de um método de diagnóstico e estudados como potenciais alvos para fármacos. Para este estudo, foi realizado um trabalho de colaboração em Moçambique, onde foram colhidas amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados, em cinco explorações situadas na província de Maputo, no sul do país. Um novo método de detecção molecular por PCR foi desenvolvido e testado utilizando DNA genómico e amostras de campo aleatórias colhidas numa das explorações. Os iniciadores de PCR foram desenhados com base no gene putativo da protease aspártica babesipsina-1 identificado nos genomas de Babesia bigemina e de B. bovis. O novo seminested hot-start PCR foi desenvolvido utilizando a combinação de iniciadores longos de 30 pb de comprimento e uma hot-start polimerase, que permitem teoricamente a utilização de temperaturas de emparelhamento acima da temperatura de melting, impedindo assim a formação de amplificações não específicas, o que aumenta a especificidade do método. O novo seminested hot-start PCR foi avaliado utilizando 117 amostras de campo, e em paralelo com um método amplamente utilizado, o nested PCR. O seminested hot-start PCR neste estudo foi mais sensível que o nested PCR. Com o seminested hot-start PCR, 90% das amostras foram positivas para B. bigemina, e 82% foram positivas para B. bovis. Os resultados sugeriram que a babesiose bovina é comum e endémica em Moçambique, e que a doença se encontra numa situação de estabilidade endémica. O estudo do estado da babesiose bovina em Moçambique, foi então aprofundado, através da análise de amostras de campo aleatórias de mais quatro explorações utilizando o seminested hot-start PCR. Todas as amostras das cinco explorações foram também analisadas utilizando o RLB, e os resultados deste método foram comparados com os dados obtidos pelo seminested hot-start PCR. A detecção de Babesia spp. diferiu significativamente entre os métodos utilizados e os locais de recolha. Com o seminested hot-start PCR, a detecção de B. bigemina nas várias explorações, variou entre 30% e 89%, com uma detecção total de 61%, e a detecção de B. bovis variou entre 27% e 83% com uma frequência global de 53%. Utilizando o RLB, não foi detectado B. bigemina e a detecção de B. bovis variou entre 0% e 17% com uma frequência total de 5,1%. A análise de novas sequências do gene 18S rRNA, revelou que a actual sonda do RLB para B. bigemina não é adequada para a detecção de todos os isolados desta espécie identificados em Moçambique. O seminested hot-start PCR foi portanto mais sensível que o RLB. No entanto, dez espécies diferentes dos quatro Géneros Anaplasma, Babesia, Ehrlichia e Theileria foram detectadas pelo ensaio RLB, e isso demonstra que as infecções múltiplas são comuns em Moçambique. Os resultados deste estudo mostram que a babesiose bovina é comum na província de Maputo, e também que existem alguns locais com baixa prevalência de infecções, e portanto, os resultados sugerem que esta doença não está numa situação de estabilidade endémica na província de Maputo. São agora necessários novos estudos epidemiológicos para confirmar estes resultados. Tem sido demonstrado que as proteases têm papéis essenciais em parasitas protozoários e estão sob estudo como promissores alvos de fármacos. Algumas proteases cisteínicas de parasitas protozoários, são já reconhecidos alvos de fármacos, e encontram-se em validação inibidores específicos para a quimioterapia da leishmaniose, da malária e da tripanossomíase. Neste estudo, o nosso principal interesse na identificação e caracterização de proteases como alvos de fármacos foi portanto nesta classe de proteases. Foram identificados no banco de dados do projecto em curso de sequenciação do genoma de B. bigemina, os genes putativos de proteases cisteínicas em pesquisas por similaridade de sequência, que posteriormente foram comparados com os genes anotados nos genomas completos das espécies de piroplasmas bovinos B. bovis, Theileria annulata e T. parva. Para avaliar os eventos da evolução molecular que ocorreram na família C1 de proteases cisteínicas, foram feitos alinhamentos múltiplos entre os genomas e análises das sequências obtidas destes piroplasmas de importância veterinária. Existem assim, cinco grupos distintos de genes de proteases cisteínicas da família C1 em B. bigemina (5 genes), quatro grupos em B. bovis (4 genes) e seis grupos em Theileria spp. (13 genes). No Género Theileria a evolução molecular ocorreu através da duplicação de genes e da diversificação da sequência das proteínas codificadas por estes genes. Estas importantes diferenças observadas entre os Géneros Babesia e Theileria na família das proteases cisteínicas, podem parcialmente explicar os diferentes mecanismos de infecção destas espécies, em que parasitas Babesia não invadem linfócitos e parasitas Theileria invadem primeiro os linfócitos no hospedeiro vertebrado. A babesipaína-1, uma das proteases cisteínicas identificadas no genoma de B. bigemina, foi expressa como uma proteína de fusão com a glutationa S-transferase (GST) e a respectiva fracção solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade. A babesipaína-1 recombinante apresentou actividade contra certos péptidos que são substratos típicos de proteases cisteínicas, e foi inibida por um inibidor geral da sua classe, mas o baixo rendimento da purificação da fracção solúvel impediu a sua caracterização adicional. A babesipaína-1 foi então purificada a partir da fracção insolúvel, e a proteína desnaturada foi re-enrolada e activada para produzir uma enzima activa. A análise da actividade da babesipaína-1 revelou propriedades típicas de uma protease cisteínica da família da papaína, incluindo a hidrólise de alguns péptidos que são substratos típicos da família da papaína, um pH ácido óptimo (5.5-6.0), o requisito de um ambiente redutor para ter actividade máxima, e a inibição por inibidores de proteases cisteínicas como o E-64, a leupeptina, o ALLN e a cistatina. Os resultados sugerem que a babesipaína-1 tem um papel no citosol, já que a babesipaína-1 manteve elevada actividade contra substratos a pH 7,5 (83% do máximo), uma característica incomum das proteases cisteínicas de parasitas protozoários. Assim, os resultados deste estudo demonstram que a babesiose bovina é uma infecção comum na província de Maputo em Moçambique, embora a doença não esteja numa situação de estabilidade endémica. Os resultados também sugerem que as proteases cisteínicas de Babesia spp. são alvos promissores para fármacos e consequentemente para o desenvolvimento de um tratamento eficaz para a babesiose bovina. Na sequência destes resultados foi associado um plano de trabalho futuro. Alguns pormenores e resultados deste trabalho podem ser transferidos para outros países, inclusivamente Portugal.
Autores principais:	MARTINS, Tiago Miguel Lopes
Assunto:	Parasitologia Médica Babesíase Babesiose bovina Proteases
Ano:	2009
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade Nova de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório Institucional da UNL

Descrição
Resumo:	A babesiose bovina é uma doença transmitida por carraças, que causa elevada morbidade e mortalidade, e provoca consideráveis perdas económicas devido aos esforços para controlar esta doença. As medidas de controlo da babesiose bovina incluem a erradicação ou redução de carraças, correcto diagnóstico, assim como tratamento e vacinação apropriados. Este trabalho tem como objectivo contribuir para um melhor diagnóstico da infecção e a consequente melhoria de algumas das medidas de controlo, bem como identificar e caracterizar genes de proteases utilizados para o desenvolvimento de um método de diagnóstico e estudados como potenciais alvos para fármacos. Para este estudo, foi realizado um trabalho de colaboração em Moçambique, onde foram colhidas amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados, em cinco explorações situadas na província de Maputo, no sul do país. Um novo método de detecção molecular por PCR foi desenvolvido e testado utilizando DNA genómico e amostras de campo aleatórias colhidas numa das explorações. Os iniciadores de PCR foram desenhados com base no gene putativo da protease aspártica babesipsina-1 identificado nos genomas de Babesia bigemina e de B. bovis. O novo seminested hot-start PCR foi desenvolvido utilizando a combinação de iniciadores longos de 30 pb de comprimento e uma hot-start polimerase, que permitem teoricamente a utilização de temperaturas de emparelhamento acima da temperatura de melting, impedindo assim a formação de amplificações não específicas, o que aumenta a especificidade do método. O novo seminested hot-start PCR foi avaliado utilizando 117 amostras de campo, e em paralelo com um método amplamente utilizado, o nested PCR. O seminested hot-start PCR neste estudo foi mais sensível que o nested PCR. Com o seminested hot-start PCR, 90% das amostras foram positivas para B. bigemina, e 82% foram positivas para B. bovis. Os resultados sugeriram que a babesiose bovina é comum e endémica em Moçambique, e que a doença se encontra numa situação de estabilidade endémica. O estudo do estado da babesiose bovina em Moçambique, foi então aprofundado, através da análise de amostras de campo aleatórias de mais quatro explorações utilizando o seminested hot-start PCR. Todas as amostras das cinco explorações foram também analisadas utilizando o RLB, e os resultados deste método foram comparados com os dados obtidos pelo seminested hot-start PCR. A detecção de Babesia spp. diferiu significativamente entre os métodos utilizados e os locais de recolha. Com o seminested hot-start PCR, a detecção de B. bigemina nas várias explorações, variou entre 30% e 89%, com uma detecção total de 61%, e a detecção de B. bovis variou entre 27% e 83% com uma frequência global de 53%. Utilizando o RLB, não foi detectado B. bigemina e a detecção de B. bovis variou entre 0% e 17% com uma frequência total de 5,1%. A análise de novas sequências do gene 18S rRNA, revelou que a actual sonda do RLB para B. bigemina não é adequada para a detecção de todos os isolados desta espécie identificados em Moçambique. O seminested hot-start PCR foi portanto mais sensível que o RLB. No entanto, dez espécies diferentes dos quatro Géneros Anaplasma, Babesia, Ehrlichia e Theileria foram detectadas pelo ensaio RLB, e isso demonstra que as infecções múltiplas são comuns em Moçambique. Os resultados deste estudo mostram que a babesiose bovina é comum na província de Maputo, e também que existem alguns locais com baixa prevalência de infecções, e portanto, os resultados sugerem que esta doença não está numa situação de estabilidade endémica na província de Maputo. São agora necessários novos estudos epidemiológicos para confirmar estes resultados. Tem sido demonstrado que as proteases têm papéis essenciais em parasitas protozoários e estão sob estudo como promissores alvos de fármacos. Algumas proteases cisteínicas de parasitas protozoários, são já reconhecidos alvos de fármacos, e encontram-se em validação inibidores específicos para a quimioterapia da leishmaniose, da malária e da tripanossomíase. Neste estudo, o nosso principal interesse na identificação e caracterização de proteases como alvos de fármacos foi portanto nesta classe de proteases. Foram identificados no banco de dados do projecto em curso de sequenciação do genoma de B. bigemina, os genes putativos de proteases cisteínicas em pesquisas por similaridade de sequência, que posteriormente foram comparados com os genes anotados nos genomas completos das espécies de piroplasmas bovinos B. bovis, Theileria annulata e T. parva. Para avaliar os eventos da evolução molecular que ocorreram na família C1 de proteases cisteínicas, foram feitos alinhamentos múltiplos entre os genomas e análises das sequências obtidas destes piroplasmas de importância veterinária. Existem assim, cinco grupos distintos de genes de proteases cisteínicas da família C1 em B. bigemina (5 genes), quatro grupos em B. bovis (4 genes) e seis grupos em Theileria spp. (13 genes). No Género Theileria a evolução molecular ocorreu através da duplicação de genes e da diversificação da sequência das proteínas codificadas por estes genes. Estas importantes diferenças observadas entre os Géneros Babesia e Theileria na família das proteases cisteínicas, podem parcialmente explicar os diferentes mecanismos de infecção destas espécies, em que parasitas Babesia não invadem linfócitos e parasitas Theileria invadem primeiro os linfócitos no hospedeiro vertebrado. A babesipaína-1, uma das proteases cisteínicas identificadas no genoma de B. bigemina, foi expressa como uma proteína de fusão com a glutationa S-transferase (GST) e a respectiva fracção solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade. A babesipaína-1 recombinante apresentou actividade contra certos péptidos que são substratos típicos de proteases cisteínicas, e foi inibida por um inibidor geral da sua classe, mas o baixo rendimento da purificação da fracção solúvel impediu a sua caracterização adicional. A babesipaína-1 foi então purificada a partir da fracção insolúvel, e a proteína desnaturada foi re-enrolada e activada para produzir uma enzima activa. A análise da actividade da babesipaína-1 revelou propriedades típicas de uma protease cisteínica da família da papaína, incluindo a hidrólise de alguns péptidos que são substratos típicos da família da papaína, um pH ácido óptimo (5.5-6.0), o requisito de um ambiente redutor para ter actividade máxima, e a inibição por inibidores de proteases cisteínicas como o E-64, a leupeptina, o ALLN e a cistatina. Os resultados sugerem que a babesipaína-1 tem um papel no citosol, já que a babesipaína-1 manteve elevada actividade contra substratos a pH 7,5 (83% do máximo), uma característica incomum das proteases cisteínicas de parasitas protozoários. Assim, os resultados deste estudo demonstram que a babesiose bovina é uma infecção comum na província de Maputo em Moçambique, embora a doença não esteja numa situação de estabilidade endémica. Os resultados também sugerem que as proteases cisteínicas de Babesia spp. são alvos promissores para fármacos e consequentemente para o desenvolvimento de um tratamento eficaz para a babesiose bovina. Na sequência destes resultados foi associado um plano de trabalho futuro. Alguns pormenores e resultados deste trabalho podem ser transferidos para outros países, inclusivamente Portugal.