Publicação

Efeito de vesículas extracelulares das espécies cutâneas Leishmania shawi e Leishmania guyanensis na imunomodulação de macrófagos murinos

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A leishmaniose é uma parasitose causada por protozoários de diferentes espécies do género Leishmania spp. e transmitida através da picada de espécies vetoras de flebótomos. Esta doença apresenta diferentes características clínicas dependendo da espécie e da situação imunológica do hospedeiro: cutânea, mucocutânea e visceral. Os macrófagos (MФ) são células fagocíticas e apresentadoras de antigénios responsáveis pela defesa inata do hospedeiro, sendo também as células alvo para infecção pelo parasitaLeishmania. O tratamento desta infecção é moroso e tem associado um grande número de efeitos secundários severos, não havendo muitas alternativas terapêuticas. Assim, compreender como a interação entre o parasita e o seu hospedeiro decorre, pode revelar novas oportunidadespara a prevenção da infeção e/ou terapia. Um elemento que tem vindo a ser considerado chave nesta interação parasita-hospedeiro são as vesículas extracelulares (VEs) naturalmente produzidas pelos parasitas durante o seu ciclo de vida. Osprincipais ojetivos deste estudo foram: (i) isolar vesículas extracelulares (VEs) de L. shawi e L. guyanensis, espécies causadoras de leishmaniosecutânea em humanos; (ii) caracterizar a forma, o diâmetro, o potencial zeta e a constituição proteicautilizando microscopia electrónica de varrimento (MEV),dynamic light scattering(DLS),electrophretic light scattering (ELS), eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e zimografia, respectivamente; (iii) investigar a incorporação das vesículas por MФ, utilizando a linha celular P388D1, por meio de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência; (iv) avaliar o potencial imunogênico das VEs na ativação dos MФ através da quantificação da produção de óxido nítrico (NO) euréia, da ativação de receptores de superfície MHCI e MHCII por citometria de fluxo e da análise da expressão génica de citocinas (IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12p40 e TNF-α) e de receptores de imunidade inata NOD-like (NOD1 e NOD2) e Toll-like (TLR2, TLR4 e TLR9) por PCR semi-quantitativo em tempo real.A metodologia utilizada neste estudo foi eficiente para o isolamento de VEs com diâmetro compatível com exossomas (30-100 nm) com forma esférica e uniforme. Além disso, as VEs isoladas apresentaram perfil de bandas protéicos compatível com a literatura existente para exossomas, identificando principalmete a metaloprotease GP63. As VEs das espécies de L. shawi e L. guyanensis foram incorporadas por MФ, ativando a produção de NO e reduzindo a produção de uréia gerando um ambiente desfavorável à sobrevivência intracelular do parasita. Além disso, essas vesículas aumentaram a população de células MHCI+ e MHCII+, indicando que esses MФ poderiam apresentar antigénios aos linfócitos T. Ademais, as VEs modularam a expressão génica de citocinas aumentando principalmente a produção de citocinas inflamatórias (IL-1β e IL-12p40). Os receptores de imunidade inata NODs, TLR4 e TLR9 também tiveram suas expressões moduladas por VEs, principalmente por VEsda espécie L. shawi.O efeito gerado por VEs das espécies analisadas nos MФ murinos mostrou que essas vesículas são promissoras para a continuação dos estudos que visam o desenvolvimento de alvos terapêuticos e profilácticos anti-Leishmania.
Autores principais:	WEBER, Juliana Inês
Assunto:	Parasitologia médica Leishmania shawi Leishmania guyanensis Leishmaniose cutânea Vesículas extracelulares Imunomodulação
Ano:	2021
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade Nova de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório Institucional da UNL

Descrição
Resumo:	A leishmaniose é uma parasitose causada por protozoários de diferentes espécies do género Leishmania spp. e transmitida através da picada de espécies vetoras de flebótomos. Esta doença apresenta diferentes características clínicas dependendo da espécie e da situação imunológica do hospedeiro: cutânea, mucocutânea e visceral. Os macrófagos (MФ) são células fagocíticas e apresentadoras de antigénios responsáveis pela defesa inata do hospedeiro, sendo também as células alvo para infecção pelo parasitaLeishmania. O tratamento desta infecção é moroso e tem associado um grande número de efeitos secundários severos, não havendo muitas alternativas terapêuticas. Assim, compreender como a interação entre o parasita e o seu hospedeiro decorre, pode revelar novas oportunidadespara a prevenção da infeção e/ou terapia. Um elemento que tem vindo a ser considerado chave nesta interação parasita-hospedeiro são as vesículas extracelulares (VEs) naturalmente produzidas pelos parasitas durante o seu ciclo de vida. Osprincipais ojetivos deste estudo foram: (i) isolar vesículas extracelulares (VEs) de L. shawi e L. guyanensis, espécies causadoras de leishmaniosecutânea em humanos; (ii) caracterizar a forma, o diâmetro, o potencial zeta e a constituição proteicautilizando microscopia electrónica de varrimento (MEV),dynamic light scattering(DLS),electrophretic light scattering (ELS), eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e zimografia, respectivamente; (iii) investigar a incorporação das vesículas por MФ, utilizando a linha celular P388D1, por meio de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência; (iv) avaliar o potencial imunogênico das VEs na ativação dos MФ através da quantificação da produção de óxido nítrico (NO) euréia, da ativação de receptores de superfície MHCI e MHCII por citometria de fluxo e da análise da expressão génica de citocinas (IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12p40 e TNF-α) e de receptores de imunidade inata NOD-like (NOD1 e NOD2) e Toll-like (TLR2, TLR4 e TLR9) por PCR semi-quantitativo em tempo real.A metodologia utilizada neste estudo foi eficiente para o isolamento de VEs com diâmetro compatível com exossomas (30-100 nm) com forma esférica e uniforme. Além disso, as VEs isoladas apresentaram perfil de bandas protéicos compatível com a literatura existente para exossomas, identificando principalmete a metaloprotease GP63. As VEs das espécies de L. shawi e L. guyanensis foram incorporadas por MФ, ativando a produção de NO e reduzindo a produção de uréia gerando um ambiente desfavorável à sobrevivência intracelular do parasita. Além disso, essas vesículas aumentaram a população de células MHCI+ e MHCII+, indicando que esses MФ poderiam apresentar antigénios aos linfócitos T. Ademais, as VEs modularam a expressão génica de citocinas aumentando principalmente a produção de citocinas inflamatórias (IL-1β e IL-12p40). Os receptores de imunidade inata NODs, TLR4 e TLR9 também tiveram suas expressões moduladas por VEs, principalmente por VEsda espécie L. shawi.O efeito gerado por VEs das espécies analisadas nos MФ murinos mostrou que essas vesículas são promissoras para a continuação dos estudos que visam o desenvolvimento de alvos terapêuticos e profilácticos anti-Leishmania.