Publicação
Spore surface display of enzymes used for molecular diagnosis by RT-LAMP
| Resumo: | O uso de enzimas em larga escala para aplicações industriais ou diagnóstico molecular é limitado devido ao alto custo de produção e purificação e à baixa estabilidade das mesmas. Estas dificuldades limitam a utilização destas enzimas por laboratórios com orçamentos limitados. O LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) é um teste de amplificação de ácidos nucleicos desenvolvido nos anos 2000 como alternativa mais barata e simples ao PCR na deteção de patogénios, o teste mais utilizado no diagnostico molecular. A principal enzima utilizada no LAMP é a polimerase de DNA Bst do Bacillus stearothermophillus. No caso da deteção de patogénios que têm RNA como o seu material genético, é necessário a adição de uma transcriptase reversa à reação de LAMP (RT LAMP). LAMP não necessita de ciclos de temperatura e por isso consegue ser implementado em laboratórios com poucos recursos. De modo a tornar esta técnica mais acessível, seria de interesse desenvolver uma plataforma simples e robusta para a produção e purificação da Bst e da transcriptase reversa. Esta ideia poderia ser posta em prática com a apresentação destas enzimas à superfície de um organismo de forma a contornar purificações, aumentar a sua estabilidade e permitir a sua reutilização. Uma das opções mais bem estudada são os esporos de Bacillus subtilis, que foram usados com sucesso no passado para a apresentação de diversas proteínas à sua superfície com vista a diversas aplicações em biotecnologia e biomedicina. Este estudo foca-se na apresentação das enzimas utilizadas em RT-LAMP, a Bst e a MashUp-RT, na superfície dos esporos de Bacillus subtilis. De modo a obter uma maior quantidade de enzima e aumentar a exposição destas, as proteínas escolhidas como âncora foram CotZ e CotY. Ambas são componentes abundantes da crosta, a camada mais exterior do esporo. Conseguimos apresentar ambas as enzimas à superfície do esporo, com um impacto mínimo no rendimento da produção de esporos e na sua estrutura e propriedades. É importante notar que, quando CotZ foi utilizada como âncora, várias proteínas do manto externo do esporo estavam ausentes, sugerindo que esta é importante para manter a integridade do manto externo. Também foi avaliado se esta metodologia poderia ser utilizada na deteção de material genético de patogénios. Apenas a enzima MashUp-RT apresentou atividade enzimática. Curiosamente, embora os esporos recombinantes apresentando Bst não mostrassem atividade de DNA polimerase, a atividade residual de transcriptase reversa da Bst comercial foi estabilizada na presença de esporos selvagens. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro estudo sobre a apresentação de enzimas utilizadas no diagnóstico molecular à superfície do esporo. |
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| Autores principais: | NEVES, Constança Maria Baptista Machado dos Santos |
| Assunto: | Microbiologia Bacillus subtilis Esporos Crosta Display-esporos RT-LAMP |
| Ano: | 2022 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade Nova de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório Institucional da UNL |
| Resumo: | O uso de enzimas em larga escala para aplicações industriais ou diagnóstico molecular é limitado devido ao alto custo de produção e purificação e à baixa estabilidade das mesmas. Estas dificuldades limitam a utilização destas enzimas por laboratórios com orçamentos limitados. O LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) é um teste de amplificação de ácidos nucleicos desenvolvido nos anos 2000 como alternativa mais barata e simples ao PCR na deteção de patogénios, o teste mais utilizado no diagnostico molecular. A principal enzima utilizada no LAMP é a polimerase de DNA Bst do Bacillus stearothermophillus. No caso da deteção de patogénios que têm RNA como o seu material genético, é necessário a adição de uma transcriptase reversa à reação de LAMP (RT LAMP). LAMP não necessita de ciclos de temperatura e por isso consegue ser implementado em laboratórios com poucos recursos. De modo a tornar esta técnica mais acessível, seria de interesse desenvolver uma plataforma simples e robusta para a produção e purificação da Bst e da transcriptase reversa. Esta ideia poderia ser posta em prática com a apresentação destas enzimas à superfície de um organismo de forma a contornar purificações, aumentar a sua estabilidade e permitir a sua reutilização. Uma das opções mais bem estudada são os esporos de Bacillus subtilis, que foram usados com sucesso no passado para a apresentação de diversas proteínas à sua superfície com vista a diversas aplicações em biotecnologia e biomedicina. Este estudo foca-se na apresentação das enzimas utilizadas em RT-LAMP, a Bst e a MashUp-RT, na superfície dos esporos de Bacillus subtilis. De modo a obter uma maior quantidade de enzima e aumentar a exposição destas, as proteínas escolhidas como âncora foram CotZ e CotY. Ambas são componentes abundantes da crosta, a camada mais exterior do esporo. Conseguimos apresentar ambas as enzimas à superfície do esporo, com um impacto mínimo no rendimento da produção de esporos e na sua estrutura e propriedades. É importante notar que, quando CotZ foi utilizada como âncora, várias proteínas do manto externo do esporo estavam ausentes, sugerindo que esta é importante para manter a integridade do manto externo. Também foi avaliado se esta metodologia poderia ser utilizada na deteção de material genético de patogénios. Apenas a enzima MashUp-RT apresentou atividade enzimática. Curiosamente, embora os esporos recombinantes apresentando Bst não mostrassem atividade de DNA polimerase, a atividade residual de transcriptase reversa da Bst comercial foi estabilizada na presença de esporos selvagens. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro estudo sobre a apresentação de enzimas utilizadas no diagnóstico molecular à superfície do esporo. |
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