Publicação
Evaluation of the effect of protease inhibitors on in vitro culture of Babesia ovis
| Resumo: | A babesiose é uma doença causada por protozoários do género Babesia com impactos consideráveis a nível de saúde animal e também económico em diversos países. Este parasita é transmitido por carraças, engloba um elevado número de espécies e afeta diversos vertebrados. Em particular Babesia ovis, transmitida maioritariamente pela espécie Rhipicephalus bursa, é causadora da babesiose ovina, reconhecendo-se a sua alta taxa de mortalidade em animais infetados, causando prejuízos para muitos produtores. Atualmente as medidas de controlo disponíveis baseiam-se na utilização de fármacos e vacinas atenuadas direcionadas ao parasita e acaricidas direcionadas aos vetores. Os fármacos mais utilizados são o dipropionato de imidocarb e o aceturato de diminazeno. No entanto a toxicidade, contaminações no leite e carne e ainda inibição do parasita incompleta, tornam essencial a procura de novos fármacos, que permitam eliminação do parasita de forma segura para os animais. Durante muitos anos, a microscopia foi amplamente utilizada para o screening de compostos e fármacos contra Babesia. No entanto, com os avanços tecnológicos e o desenvolvimento de métodos moleculares, surgiram novas técnicas que revolucionaram esta área. Métodos como a PCR quantitativa (qPCR) e os ensaios de alta eficiência (high-throughput screening) permitiram implementar abordagens mais rápidas e eficazes, possibilitando o teste simultâneo de inúmeros fármacos. Os métodos baseados em fluorescência são soluções que permitem a testagem de compostos em pouco tempo e de forma sensível. Nesta abordagem o sinal de fluorescência pode ser analisado recorrendo a técnicas diferentes como a citometria de fluxo ou o uso de um fluorímetro. Enquanto a primeira analisa as células individualmente, permitindo detalhar sobre a distribuição da fluorescência em diferentes subpopulações celulares, a segunda fornece um valor de fluorescência total ou médio da amostra, ideal para comparações entre amostras diferentes. De facto, esta última técnica está otimizada para outros Apicomplexa mostrando-se indicada para o screening em larga escala de potenciais agentes terapêuticos. Assim, o presente trabalho tem como objetivos primários a otimização de um protocolo de fluorescência e ainda a avaliação da inibição de crescimento de B. ovis por um painel de compostos, os quais se especula que inibam protéases cisteínicas. Para alcançar os objetivos propostos a linearidade entre parasitémia e unidades de fluorescência relativos foi determinada, bem como as condições ideais para a realização de ensaios relativamente à sua duração, troca diária de meio de cultura e hematócrito. O efeito inibitório da atovaquona, imidocarb, tulatromicina e blasticidina-S foram avaliados de forma a selecionar um controlo robusto. Os resultados mostram que as melhores condições para o ensaio são a realização do mesmo ao longo de 96 horas, com troca diária de meio e utilizando um hematócrito de 10%. A atovaquona e blasticidina-S foram capazes de inibir totalmente o crescimento de B. ovis. Dos 24 compostos testados a 5 μM, dois compostos demonstram uma percentagem de inibição superior a 80%. Este trabalho reporta, pela primeira vez a otimização de um protocolo baseado em fluorescência para a testagem de compostos anti-B. ovis. |
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| Autores principais: | MALAQUIAS, Jéssica Sofia Vieira |
| Assunto: | Microbiologia Biologia molecular Carraças |
| Ano: | 2025 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade Nova de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório Institucional da UNL |
| Resumo: | A babesiose é uma doença causada por protozoários do género Babesia com impactos consideráveis a nível de saúde animal e também económico em diversos países. Este parasita é transmitido por carraças, engloba um elevado número de espécies e afeta diversos vertebrados. Em particular Babesia ovis, transmitida maioritariamente pela espécie Rhipicephalus bursa, é causadora da babesiose ovina, reconhecendo-se a sua alta taxa de mortalidade em animais infetados, causando prejuízos para muitos produtores. Atualmente as medidas de controlo disponíveis baseiam-se na utilização de fármacos e vacinas atenuadas direcionadas ao parasita e acaricidas direcionadas aos vetores. Os fármacos mais utilizados são o dipropionato de imidocarb e o aceturato de diminazeno. No entanto a toxicidade, contaminações no leite e carne e ainda inibição do parasita incompleta, tornam essencial a procura de novos fármacos, que permitam eliminação do parasita de forma segura para os animais. Durante muitos anos, a microscopia foi amplamente utilizada para o screening de compostos e fármacos contra Babesia. No entanto, com os avanços tecnológicos e o desenvolvimento de métodos moleculares, surgiram novas técnicas que revolucionaram esta área. Métodos como a PCR quantitativa (qPCR) e os ensaios de alta eficiência (high-throughput screening) permitiram implementar abordagens mais rápidas e eficazes, possibilitando o teste simultâneo de inúmeros fármacos. Os métodos baseados em fluorescência são soluções que permitem a testagem de compostos em pouco tempo e de forma sensível. Nesta abordagem o sinal de fluorescência pode ser analisado recorrendo a técnicas diferentes como a citometria de fluxo ou o uso de um fluorímetro. Enquanto a primeira analisa as células individualmente, permitindo detalhar sobre a distribuição da fluorescência em diferentes subpopulações celulares, a segunda fornece um valor de fluorescência total ou médio da amostra, ideal para comparações entre amostras diferentes. De facto, esta última técnica está otimizada para outros Apicomplexa mostrando-se indicada para o screening em larga escala de potenciais agentes terapêuticos. Assim, o presente trabalho tem como objetivos primários a otimização de um protocolo de fluorescência e ainda a avaliação da inibição de crescimento de B. ovis por um painel de compostos, os quais se especula que inibam protéases cisteínicas. Para alcançar os objetivos propostos a linearidade entre parasitémia e unidades de fluorescência relativos foi determinada, bem como as condições ideais para a realização de ensaios relativamente à sua duração, troca diária de meio de cultura e hematócrito. O efeito inibitório da atovaquona, imidocarb, tulatromicina e blasticidina-S foram avaliados de forma a selecionar um controlo robusto. Os resultados mostram que as melhores condições para o ensaio são a realização do mesmo ao longo de 96 horas, com troca diária de meio e utilizando um hematócrito de 10%. A atovaquona e blasticidina-S foram capazes de inibir totalmente o crescimento de B. ovis. Dos 24 compostos testados a 5 μM, dois compostos demonstram uma percentagem de inibição superior a 80%. Este trabalho reporta, pela primeira vez a otimização de um protocolo baseado em fluorescência para a testagem de compostos anti-B. ovis. |
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