Publicação

Produção de virus like particles (VLPs) do vírus chikungunya (CHIKV)

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O vírus Chikungunya (CHIKV) é um alfavírus, transmitido por mosquitos, que causa infecção aguda no Homem caracterizada por febre, mialgia e poliartrite dolorosa e incapacitante que pode durar meses ou anos. Descrito pela primeira vez na Tanzânia em 1952, tornou-se endémico em África, Índia e sudeste Asiático. Desde 2005, os surtos no oceano Índico e no continente Asiático têm atingido proporções e virulência atípicas, com muitos milhares de indivíduos infectados e mortalidade associada. A mobilidade de indivíduos infectados e a alteração dos padrões de distribuição e abundância dos vectores devido a alterações climáticas, tornaram o CHIKV uma ameaça global sem estratégias de controlo eficazes. Uma abordagem para o controlo da transmissão será o desenvolvimento de uma vacina eficaz. As virus-like particles (VLPs) são uma classe segura e eficaz de vacinas que simulam a estrutura nativa das partículas virais. Neste trabalho pretendemos obter um vector de expressão recombinante, capaz de induzir a síntese de VLPs de CHIKV quando transfectado em culturas celulares, como fonte da sequência codificante da poliproteína estrutural para clonagem em baculovírus e produção de VLPs em células de insecto. A ORF estrutural de CHIKV foi amplificada por RT-PCR como um fragmento SacI-NotI e clonada no vector de expressão pLEXm a jusante do promotor forte da beta actina de galinha. Obtiveram-se vários clones com o tamanho correcto do inserto, os quais foram usados para transfectar células HEK 293T usando polietilenimina como agente de fusão. A análise por imunofluorescência indirecta (IF) e Western blotting (WB) de células transfectadas, usando um soro policlonal anti-CHIKV, demonstrou que cinco vectores recombinantes expressavam antigénios virais. Um clone apresentou níveis elevados de fluorescência apenas quando da permeabilização celular e induz, muito provavelmente, a síntese de uma glicoproteína E2 truncada (26 kDa) que não é transportada até à membrana citoplasmática. Três clones deram origem a intensidades de fluorescência relativamente fracas que poderão estar correlacionadas com menor taxa de tradução e/ou processsamento incompleto. As células transfectadas com pLCHIKS67 revelaram fluorescência e padrão proteico em WB semelhante aos de células infectadas com CHIKV. Ainda, o seu sobrenandante de cultura quando precipitado com PEG 8000 revelou (WB) uma composição de antigénios virais idêntica ao precipitado correspondente de células infectadas com CHIKV. A análise por microscopia electrónica de transmissão de células infectadas com CHIKV e de células transfectadas com pLCHIKS67 demonstrou a presença de VLPs nestas últimas, com dimensões e morfologia idênticas às partículas virais, e ainda um extenso rearranjo de membranas intracelulares, observado igualmente nas células infectadas, o qual deverá estar associado à tradução, processamento e transporte das proteínas estruturais. De acordo com os resultados obtidos, pLCHIKS67 será uma boa fonte da sequência nucleotídica da poliproteína estrutural para usar na geração de baculovírus produtores de VPLs de CHIKV.
Autores principais:	VELEZ, André Filipe Marques
Assunto:	Virus-like particles, vírus chikungunya, pLEXm, transfecção com polietilenimina, Biologia molecular Doenças tropicais Chikungunya Vacina Mortalidade VLPs - Virus Like Particles
Ano:	2012
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade Nova de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório Institucional da UNL

Descrição
Resumo:	O vírus Chikungunya (CHIKV) é um alfavírus, transmitido por mosquitos, que causa infecção aguda no Homem caracterizada por febre, mialgia e poliartrite dolorosa e incapacitante que pode durar meses ou anos. Descrito pela primeira vez na Tanzânia em 1952, tornou-se endémico em África, Índia e sudeste Asiático. Desde 2005, os surtos no oceano Índico e no continente Asiático têm atingido proporções e virulência atípicas, com muitos milhares de indivíduos infectados e mortalidade associada. A mobilidade de indivíduos infectados e a alteração dos padrões de distribuição e abundância dos vectores devido a alterações climáticas, tornaram o CHIKV uma ameaça global sem estratégias de controlo eficazes. Uma abordagem para o controlo da transmissão será o desenvolvimento de uma vacina eficaz. As virus-like particles (VLPs) são uma classe segura e eficaz de vacinas que simulam a estrutura nativa das partículas virais. Neste trabalho pretendemos obter um vector de expressão recombinante, capaz de induzir a síntese de VLPs de CHIKV quando transfectado em culturas celulares, como fonte da sequência codificante da poliproteína estrutural para clonagem em baculovírus e produção de VLPs em células de insecto. A ORF estrutural de CHIKV foi amplificada por RT-PCR como um fragmento SacI-NotI e clonada no vector de expressão pLEXm a jusante do promotor forte da beta actina de galinha. Obtiveram-se vários clones com o tamanho correcto do inserto, os quais foram usados para transfectar células HEK 293T usando polietilenimina como agente de fusão. A análise por imunofluorescência indirecta (IF) e Western blotting (WB) de células transfectadas, usando um soro policlonal anti-CHIKV, demonstrou que cinco vectores recombinantes expressavam antigénios virais. Um clone apresentou níveis elevados de fluorescência apenas quando da permeabilização celular e induz, muito provavelmente, a síntese de uma glicoproteína E2 truncada (26 kDa) que não é transportada até à membrana citoplasmática. Três clones deram origem a intensidades de fluorescência relativamente fracas que poderão estar correlacionadas com menor taxa de tradução e/ou processsamento incompleto. As células transfectadas com pLCHIKS67 revelaram fluorescência e padrão proteico em WB semelhante aos de células infectadas com CHIKV. Ainda, o seu sobrenandante de cultura quando precipitado com PEG 8000 revelou (WB) uma composição de antigénios virais idêntica ao precipitado correspondente de células infectadas com CHIKV. A análise por microscopia electrónica de transmissão de células infectadas com CHIKV e de células transfectadas com pLCHIKS67 demonstrou a presença de VLPs nestas últimas, com dimensões e morfologia idênticas às partículas virais, e ainda um extenso rearranjo de membranas intracelulares, observado igualmente nas células infectadas, o qual deverá estar associado à tradução, processamento e transporte das proteínas estruturais. De acordo com os resultados obtidos, pLCHIKS67 será uma boa fonte da sequência nucleotídica da poliproteína estrutural para usar na geração de baculovírus produtores de VPLs de CHIKV.