Publicação

MicroRNA involvement in breast cancer susceptibility and progression

Detalhes bibliográficos
Resumo:	RESUMO: Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes com função reguladora que regulam a expressão génica ao ligar-se a sequências específicas na região 3’ UTR dos mRNAs. Diversos estudos mostraram que os miRNAs regulam mecanismos fundamentais para o normal funcionamento celular, como crescimento celular, proliferação, diferenciação e apoptose. A expressão de alguns miRNAs é alterada em diversos tipos de cancro, nomeadamente em cancro da mama. Estudos de análise funcional em linhas celulares mostraram que os miRNAs podem funcionar como supressores de tumor ou ter actividade oncogénica. Assim, o valor clínico dos miRNAs como potenciais marcadores para cancro da mama está a ser amplamente estudado de momento. No entanto, apenas se conhecem efeitos de alguns miRNAs. A maior dificuldade, neste âmbito, depreende-se com a identificação de possíveis alvos com relevância biológica para cancro da mama. Visto que os programas bioinformáticos predizem um elevado número de falsos positivos e falsos negativos, é de extrema importância identificar experimentalmente alvos relevantes. Nesta tese procuramos explorar diferentes abordagens da influência de miRNAs em cancro da mama. Começamos por estudar os mecanismos que estão por trás da regulação dos próprios miRNAs. Colocámos a hipótese de serem mecanismos epigenéticos, tais como a metilação de citosinas no DNA, que estão a influenciar os níveis de expressão dos miRNAs. Para tal, tratámos linhas celulares de mama com um agente capaz de desmetilar o DNA e verificámos que os níveis de miRNAs são alterados. Contudo, não conseguimos encontrar uma associação entre a metilação de ilhas CpG nas regiões promotoras dos genes que codificam para os miRNAs. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de os níveis de expressão de miRNAs estarem a ser regulados por metilação das suas zonas promotoras, dado que não estudámos todas as regiões promotoras existentes. De seguida, abordámos a influência de dois miRNAs, miR-200c e miR-203, na resistência para fármacos dirigidos a cancro da mama, nomeadamente, Paclitaxel e 5-fluoruacil. Para tal fizemos expressar ambos os miRNAs na linha celular MDA-MB-231 e inibir os mesmos na linha celular MCF-7. Infelizmente não fomos capazes de encontrar significado estatístico nos resultados obtidos. Contudo pudemos concluir que o miR-200c parece ter um efeito contrário nas linhas MCF-7 e MDA-MB-231 no que diz respeito ao tratamento com Paclitaxel e o miR-203 parece aumentar a resistência para o mesmo comporto na linha celular MDA-MB-231. O tratamento com 5-fluoruacil não mostrou qualquer diferença em ambas as linhas. Dado que os estudos in vitro, nesta área, devem ser transpostos para humanos e/ou tecidos humanos, seguidamente procurámos estudar os níveis de expressão do miR-200c e do miR-203 em tecido tumoral mamário, bem como a expressão de dois alvos hipotéticos encontrados utilizando ferramentas bioinformáticas, SIX1 e SOX2. Relativamente ao miR-200c, não encontrámos quaisquer diferenças entre tecido normal e tecido tumoral de mama, nem conseguimos relacionar este miRNA com características clinicopatológicas. Comparativamente detectaram-se diferenças para o miR-203 e conseguimos relacionar este com os estadios iniciais de desenvolvimento tumoral. Conseguimos também demonstrar que o miR-203 pode ser um potencial marcador para discriminar os tumores lobulares invasivos. No que diz respeito à expressão do SOX1 e SOX2, observámos que ambos possuem uma incidência baixa na nossa população e que não se associam com a expressão dos miRNAs em estudo. Por último, procurámos validar alguns alvos do miR-200c e do miR-203. Para tal, efectuámos um estudo comparativo de proteómica, onde fizemos expressar o miR-200c e o miR-203 na linha celular MDA-MB-231 e inibimos os mesmos miRNAs na linha celular MCF-10A. Este estudo exploratório, ainda por terminar, revelou aproximadamente 3000 proteínas diferentemente expressas nas linhas celulares. No entanto, até ao momento conseguimos reduzir esta vasta lista para uma menor com aproximadamente 10 proteínas para cada linha celular. De futuro, serão seguidas outras abordagens para validar estes alvos hipotéticos. Devido ao facto da população recolhida ser recente, o seguimento clínico nos próximos anos permitirá tirar algumas conclusões relativas à resistência à terapia utilizada e a sua relação com a expressão dos miRNAs em estudo.
Autores principais:	Gomes, Bruno Daniel da Costa
Assunto:	miRNAs miR-200c miR-203 Cancro da mama Metilação Regulação Resistência a fármacos IHC SIX1 SOX2 RT-qPCR Proteómica LC/MS MALDI/TOF Breast cancer Methylation Regulation Drug resistance Proteomics
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade Nova de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório Institucional da UNL

Descrição
Resumo:	RESUMO: Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes com função reguladora que regulam a expressão génica ao ligar-se a sequências específicas na região 3’ UTR dos mRNAs. Diversos estudos mostraram que os miRNAs regulam mecanismos fundamentais para o normal funcionamento celular, como crescimento celular, proliferação, diferenciação e apoptose. A expressão de alguns miRNAs é alterada em diversos tipos de cancro, nomeadamente em cancro da mama. Estudos de análise funcional em linhas celulares mostraram que os miRNAs podem funcionar como supressores de tumor ou ter actividade oncogénica. Assim, o valor clínico dos miRNAs como potenciais marcadores para cancro da mama está a ser amplamente estudado de momento. No entanto, apenas se conhecem efeitos de alguns miRNAs. A maior dificuldade, neste âmbito, depreende-se com a identificação de possíveis alvos com relevância biológica para cancro da mama. Visto que os programas bioinformáticos predizem um elevado número de falsos positivos e falsos negativos, é de extrema importância identificar experimentalmente alvos relevantes. Nesta tese procuramos explorar diferentes abordagens da influência de miRNAs em cancro da mama. Começamos por estudar os mecanismos que estão por trás da regulação dos próprios miRNAs. Colocámos a hipótese de serem mecanismos epigenéticos, tais como a metilação de citosinas no DNA, que estão a influenciar os níveis de expressão dos miRNAs. Para tal, tratámos linhas celulares de mama com um agente capaz de desmetilar o DNA e verificámos que os níveis de miRNAs são alterados. Contudo, não conseguimos encontrar uma associação entre a metilação de ilhas CpG nas regiões promotoras dos genes que codificam para os miRNAs. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de os níveis de expressão de miRNAs estarem a ser regulados por metilação das suas zonas promotoras, dado que não estudámos todas as regiões promotoras existentes. De seguida, abordámos a influência de dois miRNAs, miR-200c e miR-203, na resistência para fármacos dirigidos a cancro da mama, nomeadamente, Paclitaxel e 5-fluoruacil. Para tal fizemos expressar ambos os miRNAs na linha celular MDA-MB-231 e inibir os mesmos na linha celular MCF-7. Infelizmente não fomos capazes de encontrar significado estatístico nos resultados obtidos. Contudo pudemos concluir que o miR-200c parece ter um efeito contrário nas linhas MCF-7 e MDA-MB-231 no que diz respeito ao tratamento com Paclitaxel e o miR-203 parece aumentar a resistência para o mesmo comporto na linha celular MDA-MB-231. O tratamento com 5-fluoruacil não mostrou qualquer diferença em ambas as linhas. Dado que os estudos in vitro, nesta área, devem ser transpostos para humanos e/ou tecidos humanos, seguidamente procurámos estudar os níveis de expressão do miR-200c e do miR-203 em tecido tumoral mamário, bem como a expressão de dois alvos hipotéticos encontrados utilizando ferramentas bioinformáticas, SIX1 e SOX2. Relativamente ao miR-200c, não encontrámos quaisquer diferenças entre tecido normal e tecido tumoral de mama, nem conseguimos relacionar este miRNA com características clinicopatológicas. Comparativamente detectaram-se diferenças para o miR-203 e conseguimos relacionar este com os estadios iniciais de desenvolvimento tumoral. Conseguimos também demonstrar que o miR-203 pode ser um potencial marcador para discriminar os tumores lobulares invasivos. No que diz respeito à expressão do SOX1 e SOX2, observámos que ambos possuem uma incidência baixa na nossa população e que não se associam com a expressão dos miRNAs em estudo. Por último, procurámos validar alguns alvos do miR-200c e do miR-203. Para tal, efectuámos um estudo comparativo de proteómica, onde fizemos expressar o miR-200c e o miR-203 na linha celular MDA-MB-231 e inibimos os mesmos miRNAs na linha celular MCF-10A. Este estudo exploratório, ainda por terminar, revelou aproximadamente 3000 proteínas diferentemente expressas nas linhas celulares. No entanto, até ao momento conseguimos reduzir esta vasta lista para uma menor com aproximadamente 10 proteínas para cada linha celular. De futuro, serão seguidas outras abordagens para validar estes alvos hipotéticos. Devido ao facto da população recolhida ser recente, o seguimento clínico nos próximos anos permitirá tirar algumas conclusões relativas à resistência à terapia utilizada e a sua relação com a expressão dos miRNAs em estudo.