Publicação
Stem cell-derived retinal pigment epithelium models of lysosomal dysfunction in disease
| Resumo: | RESUMO:As doenças degenerativas da retina são as principais responsáveis pela perda de visão, nos países desenvolvidos. Frequentemente, a degeneração dos fotorrecetores ocorre devido à perda de função do Epitélio Pigmentar da Retina (RPE). A Degenerescência Macular relacionada com a idade (DMI) é uma doença degenerativa da área central da retina (mácula) que provoca uma perda progressiva da visão central. Pensa-se que a disfunção do RPE está na origem desta doença. Em particular, pensa-se que a conservação da função lisossomal destas células é de extrema importância no contexto de doença. O RPE é responsável por degradar e reutilizar componentes celulares, como proteínas e lípidos, que resultam do processamento diário dos terminais dos fotorrecetores, necessários ao bom funcionamento celular e ao processo visual. O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade. As células estaminais pluripotentes (hPSc) podem ser usadas como matéria prima para obter modelos de RPE in vitro fiáveis, que permitem ter acesso direto para identificar os mecanismos iniciais de doenças degenerativas da retina. O potencial de proliferação das células estaminais é praticamente ilimitado, pelo que a diferenciação destas células para RPE permite estabelecer uma produção sistemática de linhas humanas de RPE. Isto permite ultrapassar obstáculos existentes com as linhas de RPE disponíveis menos fiáveis ou mais difíceis de obter por culturas primárias. O trabalho aqui apresentado visou o desenvolvimento e a caracterização de um modelo in vitro de RPE derivado de células estaminais pluripotentes, com o objetivo final de estudar os eventos que estão na origem das retinopatias. Este modelo foi usado para explorar a importância da função lisossomal no processamento de material intracelular e, sobretudo, o papel da disfunção lisossomal em doenças do envelhecimento, com particular ênfase na DMI. Assim, foram otimizados protocolos de diferenciação de células estaminais em RPE e as células obtidas (hPSc-RPE) foram caracterizadas em detalhe. Baseado neste modelo celular, a disfunção lisossomal causada pelo processamento dos terminais externos dos fotorrecetores é proposta aqui como ferramenta de estudo, por reproduzir características chave da DMI. Para além disso, foi também implementado e caracterizado um modelo de disfunção lisossomal farmacológico, com base no tratamento de hPSc-RPE com cloroquina. Em iv particular, as células foram submetidas a regimes prolongados de exposição a este fármaco e a função lisossomal foi avaliada em vários períodos de estímulo. Nomeadamente, as células foram sujeitas a tratamentos agudos, continuados ou crónicos e foram demonstradas respostas diferenciadas, consoante os intervalos avaliados. Em primeiro lugar, as doses de cloroquina foram estabelecidas, com base em ensaios de viabilidade, de forma a escolher um regime não letal para as células, durante os tempos de estudo. Posteriormente, foi verificada a translocação nuclear de fatores de transcrição reguladores da função lisossomal. De seguida, as propriedades características dos lisossomas foram avaliadas, incluindo a capacidade de degradação de cargas fagocíticas, endocíticas e provenientes de autofagia, a atividade proteolítica das catepsinas e a acidez luminal. Para além disso, observou-se exocitose de lisossomas após tratamento com cloroquina, e com base na ultraestrutura do RPE, foi proposto que este seja um evento chave no desenvolvimento de doença. Vários dos resultados obtidos com hPSc-RPE foram confirmados em linhas primárias de RPE, humanas e de porco, de forma a reforçar e extrapolar as conclusões do estudo e relacionar com a biologia celular do RPE em geral. Por fim, os modelos celulares de RPE demonstraram reproduzir caraterísticas fundamentais de doenças degenerativas da retina relacionadas com o envelhecimento, nomeadamente com o aparecimento de depósitos subcelulares, tipicamente usados como identificadores de DMI. Adicionalmente, na secção de material suplementar, é apresentado um trabalho complementar, desenvolvido durante o percurso do doutoramento. Este trabalho consiste em estudos sobre o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e sobre a sua regulação por parte de proteínas Rab do tráfego intracelular do recetor VEGFR2. Globalmente, este estudo abre portas a novas perspetivas para explorar modelos celulares de RPE, de forma a dissecar os mecanismos moleculares de degeneração por detrás das doenças da retina. Para além disso, os modelos aqui desenvolvidos têm o potencial para serem utilizados para estudar novas abordagens terapêuticas, de forma a restaurar a função lisossomal, e abrir caminho para estudos in vivo. Palavras-chave: Epitélio Pigmentar da Retina, diferenciação, células estaminais pluripotentes, modelos celulares de doença, disfunção lisossomal. |
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| Autores principais: | Cardoso, Maria Helena Sequeira |
| Assunto: | Epitélio Pigmentar da Retina Diferenciação Células estaminais pluripotentes Modelos celulares de doença Disfunção lisossomal Retinal Pigment Epithelium Differentiation Pluripotent stem cells Degeneration Cell-based models Lysosome dysfunction |
| Ano: | 2019 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade Nova de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório Institucional da UNL |
| Resumo: | RESUMO:As doenças degenerativas da retina são as principais responsáveis pela perda de visão, nos países desenvolvidos. Frequentemente, a degeneração dos fotorrecetores ocorre devido à perda de função do Epitélio Pigmentar da Retina (RPE). A Degenerescência Macular relacionada com a idade (DMI) é uma doença degenerativa da área central da retina (mácula) que provoca uma perda progressiva da visão central. Pensa-se que a disfunção do RPE está na origem desta doença. Em particular, pensa-se que a conservação da função lisossomal destas células é de extrema importância no contexto de doença. O RPE é responsável por degradar e reutilizar componentes celulares, como proteínas e lípidos, que resultam do processamento diário dos terminais dos fotorrecetores, necessários ao bom funcionamento celular e ao processo visual. O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade. As células estaminais pluripotentes (hPSc) podem ser usadas como matéria prima para obter modelos de RPE in vitro fiáveis, que permitem ter acesso direto para identificar os mecanismos iniciais de doenças degenerativas da retina. O potencial de proliferação das células estaminais é praticamente ilimitado, pelo que a diferenciação destas células para RPE permite estabelecer uma produção sistemática de linhas humanas de RPE. Isto permite ultrapassar obstáculos existentes com as linhas de RPE disponíveis menos fiáveis ou mais difíceis de obter por culturas primárias. O trabalho aqui apresentado visou o desenvolvimento e a caracterização de um modelo in vitro de RPE derivado de células estaminais pluripotentes, com o objetivo final de estudar os eventos que estão na origem das retinopatias. Este modelo foi usado para explorar a importância da função lisossomal no processamento de material intracelular e, sobretudo, o papel da disfunção lisossomal em doenças do envelhecimento, com particular ênfase na DMI. Assim, foram otimizados protocolos de diferenciação de células estaminais em RPE e as células obtidas (hPSc-RPE) foram caracterizadas em detalhe. Baseado neste modelo celular, a disfunção lisossomal causada pelo processamento dos terminais externos dos fotorrecetores é proposta aqui como ferramenta de estudo, por reproduzir características chave da DMI. Para além disso, foi também implementado e caracterizado um modelo de disfunção lisossomal farmacológico, com base no tratamento de hPSc-RPE com cloroquina. Em iv particular, as células foram submetidas a regimes prolongados de exposição a este fármaco e a função lisossomal foi avaliada em vários períodos de estímulo. Nomeadamente, as células foram sujeitas a tratamentos agudos, continuados ou crónicos e foram demonstradas respostas diferenciadas, consoante os intervalos avaliados. Em primeiro lugar, as doses de cloroquina foram estabelecidas, com base em ensaios de viabilidade, de forma a escolher um regime não letal para as células, durante os tempos de estudo. Posteriormente, foi verificada a translocação nuclear de fatores de transcrição reguladores da função lisossomal. De seguida, as propriedades características dos lisossomas foram avaliadas, incluindo a capacidade de degradação de cargas fagocíticas, endocíticas e provenientes de autofagia, a atividade proteolítica das catepsinas e a acidez luminal. Para além disso, observou-se exocitose de lisossomas após tratamento com cloroquina, e com base na ultraestrutura do RPE, foi proposto que este seja um evento chave no desenvolvimento de doença. Vários dos resultados obtidos com hPSc-RPE foram confirmados em linhas primárias de RPE, humanas e de porco, de forma a reforçar e extrapolar as conclusões do estudo e relacionar com a biologia celular do RPE em geral. Por fim, os modelos celulares de RPE demonstraram reproduzir caraterísticas fundamentais de doenças degenerativas da retina relacionadas com o envelhecimento, nomeadamente com o aparecimento de depósitos subcelulares, tipicamente usados como identificadores de DMI. Adicionalmente, na secção de material suplementar, é apresentado um trabalho complementar, desenvolvido durante o percurso do doutoramento. Este trabalho consiste em estudos sobre o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e sobre a sua regulação por parte de proteínas Rab do tráfego intracelular do recetor VEGFR2. Globalmente, este estudo abre portas a novas perspetivas para explorar modelos celulares de RPE, de forma a dissecar os mecanismos moleculares de degeneração por detrás das doenças da retina. Para além disso, os modelos aqui desenvolvidos têm o potencial para serem utilizados para estudar novas abordagens terapêuticas, de forma a restaurar a função lisossomal, e abrir caminho para estudos in vivo. Palavras-chave: Epitélio Pigmentar da Retina, diferenciação, células estaminais pluripotentes, modelos celulares de doença, disfunção lisossomal. |
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